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(共52张PPT)
第1节 重组DNA技术的基本工具
（第一课时）
目标
01
02
03
关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
（社会责任）
探究DNA的物理与化学性质，进行DNA分子的提取与鉴定。（科学思维）
运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。
（生命观念）
学习目标
情境视频一：从社会中来
转基因木瓜（视频）
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
转基因番木瓜
非转基因番木瓜
问题1:解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
重组DNA技术的基本工具
剪
接
运
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
情境视频一：从社会中来
01
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？
为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
2
3
4
1
合作探究一：请同学们自主阅读教材P70-71，小组合作思考讨论完成问题。
推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？几个末端？
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
主要是原核生物
来源
种类
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
特点
（1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列
（2）断开磷酸二酯键
识别序列长度
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
专一性
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
结果
形成黏性末端或平末端
(1)产生黏性末端
EcoR I
识别序列为 GAATTC
切割部位为 GA之间
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
G
C
A
A
T
T
T
A
T
A
C
G
5'
3'
3'
5'
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
黏性末端
错位切
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
结果
形成黏性末端或平末端
(1)产生平末端
Sma I
识别序列为 CCCGGG
切割部位为 CG之间
平末端
当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
5'
3'
3'
5'
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
平切
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制酶的命名
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
问题2: 你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
问题3: 为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
问题3: 为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
问题4: 选择哪种限制酶来获得抗病基因（目的基因），有什么技巧呢？有什么要求吗？
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制酶的选择技巧
图甲　　 　　　　　　图乙
根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制酶的选择技巧
图甲　　 　　　　　　图乙
根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制
　实战训练　
1.写出下列限制酶切割形成的末端序列
BamHⅠ EcoRⅠ__________________________
Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
-G
-CCTAG-
-G
-CTTAA-
-A
-TTCGA-
-A
-TCTAG-
or
-GATCC
G-
or
-AATTC
G-
or
-AGCTT
A-
or
-GATCT
A-
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
问题5: 把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理呢？
02
DNA连接酶 — “分子缝合针”
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
T G A A T T C G
A C T T A A G C
A G A A T T C T
T C T T A A G A
拓展延伸
问题5: 把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
种类
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端
（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
(1)可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来；
EcoRI DNA连接酶
(2)两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。
T
C
G
A
T
C
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
T4 DNA连接酶
既可把黏性末端“缝合”起来，又可把平末端“缝合”起来，但连接平末端效率较低。
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
问题6: DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
　实战训练　
2.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
　实战训练　
3.判断下列是否正确
(1)限制酶只能用于切割目的基因(　　)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(　　)
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　)
(5)限制酶也可以识别和切割RNA(　　)
(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　)
×
×
×
×
×
×
　实战训练　
4.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
03
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
合作探究二：请同学们自主阅读教材P72，小组合作思考讨论完成问题。
三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”
载体的作用
载体的
必要条件
载体的种类
三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”
载体的 作用
载体 的必 要条件
载体 的种
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
②具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。
③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。
④必须是安全的 ，对受体细胞无害。
①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①细菌的质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”
01
在基因工程中真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的
简言之一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
经过人工改造
特殊的标记基因 复制原点 启动子 终止子 目的基因插入位点
质粒的组成要素
质粒
02
质粒
拓展延伸：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
重组DNA分子
思考.讨论
问题7: 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
重组DNA分子
思考.讨论
问题8: 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
问题9: 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
　实战训练　
5.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源 ：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
　练习与运用　
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
　练习与运用　
一、概念检测
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A. 大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
　练习与运用　
二、拓展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
　练习与运用　
二、拓展应用
2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
A片段
B片段
　练习与运用　
二、拓展应用
A片段
B片段
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
　练习与运用　
二、拓展应用
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
练习与应用
A片段
B片段
　实战训练　
6．质粒是基因工程中常用的分子载体。下列有关质粒的说法正确的是（　　）
A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种单链环状DNA分子B．质粒的复制和表达都遵循中心法则和碱基互补配对原则C．细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行D．大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用
　实战训练　
7．限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使特定部位的化学键断开。修饰酶能对DNA或RNA的碱基进行修饰，防止DNA或RNA被限制酶破坏。某些噬菌体能寄生在特定大肠杆菌体内进行繁殖。下列叙述正确的是（　　）
A．不能被噬菌体侵染的大肠杆菌，细胞膜上可能没有噬菌体可识别的特异性受体B．能被噬菌体侵染的大肠杆菌，体内无核糖体，不能合成破坏外源DNA的限制酶C．能寄生于大肠杆菌的噬菌体，DNA上一定没有大肠杆菌限制酶的识别位点D．能寄生于大肠杆菌的噬菌体，DNA上不可能存在与大肠杆菌相同的修饰物
　实战训练　
9．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（　　）
A．大多数限制酶识别的核苷酸序列由6个核糖核苷酸组成B．不同来源的限制酶可能识别相同的序列，甚至有相同的切点C．DNA连接酶能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸片段上D．E·coliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
　实战训练　
10．下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断，以下说法正确的是（ ）
注：Y＝C或T，R＝A或G。A．限制酶切割后一定形成黏性末端B．限制酶的切割位点不一定在识别序列的内部C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列
　实战训练　
11．下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（ ）
A．限制酶SmaI和EcoRV切割形成的末端，可通过E．coliDNA连接酶相互连接B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成C．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成D．SmaI切割后产生的是黏性末端
　实战训练　
12．线虫精子在受精前，其线粒体可正常为精子运动提供所需的能量，而受精后不久精子就开启它自身的线粒体DNA“自杀”过程。线虫精子线粒体中表达一种核酸内切酶G这种核酸内切酶G除了能摧毁它自身的线粒体DNA外，还能降解线粒体的内膜，且这是一个主动的过程。下列相关叙述错误的是（　　）
A．若核酸内切酶G在受精前表达则会导致受精过程异常B．线虫父本线粒体中的DNA不会传递给后代C．受精后，线虫精子线粒体能进行正常的有氧呼吸过程D．线虫雄性精子的这种“自杀”现象是长期进化的结果
　实战训练　
13．研究发现，长期熬夜引起的昼夜节律紊乱可以改变肿瘤相关基因的表达，引起细胞癌变，对人体自身DNA修复也会产生负面影响。下列叙述正确的是（ ）
A．原癌基因在表达时，转录和翻译过程中碱基互补配对方式相同B．熬夜可能会使原癌基因过量表达进而导致患癌症的风险增加C．与正常细胞相比，癌变细胞细胞膜上的糖蛋白增多，细胞之间的黏着性显著增强D．在DNA修复过程中，需限制酶剪切错误片段中的氢键，需DNA聚合酶催化DNA片段的修复
　实战训练　
14．某家系甲、乙两种单基因遗传病的系谱图如图1所示。控制两病的基因均不在Y染色体上，已死亡个体无法知道其性状。图2是对控制甲病的基因通过PCR技术后用某限制酶处理并电泳的结果图。外周血相对骨髓而言，指被造血器官释放到血管里参与血液循环的血。下列相关叙述错误的是（ ）
A．乙病是常染色体隐性遗传病的依据是Ⅱ 、Ⅱ 正常，生出了患乙病的Ⅲ B．判定甲病是伴X显性遗传病，Ⅱ 和Ⅱ 再生育一位健康女孩的概率是1/6C．从电泳的结果可知致病基因的限制酶的切割位点移往原基因长的片段D．Ⅱ 和一位家族无相关病史的女性结婚，抽取母体外周血进行基因检测可以判断胎儿是否患病
　实战训练　
15．Holliday模型是同源染色体间基因重组的模型，揭示了交叉互换的分子机制。其过程是：①在四分体的两个非姐妹DNA的相应位点上，分别切割每个DNA的一条链，形成四个断裂点，②不同的断裂点间交互连接，形成被称为Holliday连接体的交联体，③Holliday连接体左右移动、交联体旋转、随机切割、缺口连接等。下列分析错误的是（ ）
A．Holliday连接体的观察，应选减数第一次分裂前期的细胞B．Holliday模型揭示的分子交叉互换的结果，可以借助光学显微镜进行观察C．同源染色体间交叉互换的完成，离不开限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用D．同源染色体非姐妹DNA间的交叉互换，为有性生殖生物的进化提供了丰富的原材料
　实战训练　
16．BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。探究下列问题：
(1)限制酶 (填“能”或“不能”)切割原核细胞自身的DNA，试推测其理由是 。(2)若某链状DNA分子中含有两个BamHⅠ的识别序列，该DNA分子将被切成 个片段，共断裂 个磷酸二酯键。(3)请画出BclⅠ切割后产生的末端 。(4)BamHⅠ和BclⅠ切割后产生的黏性末端能否被DNA连接酶连接 ？说明你的理由 。(5)为什么不同生物的DNA分子能拼接起来 ？
　实战训练　
16．BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。探究下列问题：
【答案】
(1) 不能 原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了(2) 3 4(3)
(4) 能 二者切割后产生的黏性末端相同，可被DNA连接酶连接。(5)①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构；③DNA分子都遵循碱基互补配对原则。

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