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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
温故知新：
植物体细胞杂交技术
打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和障碍，培育出新的作物类型。
实例：1970年，人—鼠细胞荧光标记融合实验
人细胞
鼠细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
细胞融合
人鼠杂交细胞
37°
培养40min
细胞融合
实验表明：细胞膜具有流动性
有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交？
思考：动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？
无需去除细胞壁；
全能性受限制，不能培育成新的动物个体。
显微镜下的
动物细胞融合
动物细胞融合
概念
原理
诱导方法
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜具有一定的流动性
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG)
生物法：灭活病毒诱导法
一、动物细胞融合技术
动物细胞融合特有的诱导方法
思考：灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么呢？
灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合完成的标志
动物细胞融合
结果
意义
运用
形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
第一
第二
第三
为制造单克隆抗体开辟了新途径。
研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
一、动物细胞融合技术
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
植物体细胞杂交和动物细胞融合比较
(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(　　)
(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(　　)
(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(　　)
×
√
判断下列正误
×
二、单克隆抗体及其应用
病原体
处理
呈递
辅助性T细胞
结合
记忆B细胞
浆细胞
抗体
第一信号
分裂、分化 并分泌
细胞因子
分裂分化
促进
产生分泌
第二信号
B细胞
抗原呈递细胞
结合
抗体与病原体结合后形成沉淀等，进而被其他免疫细胞吞噬消化。
摄取
知识回顾：抗体的产生
血清
（抗体主要分布部位）
传统抗体制备方法:
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
缺陷：
产量低、纯度低，特异性差
血清含量有限
(一)传统抗体制作方法及缺陷：
二、单克隆抗体及其应用
抗体1
抗体2
抗体3
抗体4
…….
动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种
抗原1
抗原2
抗原3
抗原4
B细胞1
B细胞2
B细胞3
B细胞4
…….
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
刺激
刺激
刺激
刺激
(一)传统抗体制作方法及缺陷：
二、单克隆抗体及其应用
抗体1
抗体2
抗体3
抗体4
…….
动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种
抗原1
抗原2
抗原3
抗原4
B细胞1
B细胞2
B细胞3
B细胞4
…….
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
刺激
刺激
刺激
刺激
血清中获取
纯度低
特异性差
需要
得到
若能得到大量的B细胞4就可以
(一)传统抗体制作方法及缺陷：
问题:若我们只需要大量的抗体4有什么办法吗？
二、单克隆抗体及其应用
（１）动物体内产生的特异性抗体种类多达百万种；
（２）每个B淋巴细胞（浆细胞）只分泌一种特异性的抗体。
科学家发现：
遗憾：
如何解决这一难题？
二、单克隆抗体及其应用
如何获得大量、单一的抗体？
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
B淋巴细胞不可能无限增殖
一个极富创造力的方案：
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
二、单克隆抗体及其应用
二、单克隆抗体及其应用
1. 制备单克隆抗体的原理
（1）每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，在体外培养条件下，不能无限增殖。
（2）骨髓瘤细胞能无限增殖，不能产生抗体。
（3）通过动物细胞融合技术将两种细胞融合，得到的融合细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。
骨髓瘤细胞
能无限增殖
能产生抗体
B淋巴细胞
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
注射特定的抗原,小鼠脾产生特定抗体的淋巴B细胞
2.单克隆抗体的制备过程：
B细胞1
B细胞2
B细胞3
B细胞4
B细胞2
B细胞3
B细胞4
骨髓瘤细胞
B细胞1
杂交1
杂交2
杂交3
杂交4
02
杂交瘤细胞（多种）
置于选择性培养基上培养
第一次筛选
融合的细胞
B细胞
自身融合
未融合的
B淋巴细胞
B瘤
骨髓瘤细胞
自身融合
未融合的
骨髓瘤细胞
2. 单克隆抗体的制备过程
B瘤
B瘤
第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
【第一次筛选】获得杂交瘤细胞
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
培养基中加入氨基嘌呤（HAT选择培养基）
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
克隆化培养
2. 单克隆抗体的制备过程
第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
克隆化培养
2. 单克隆抗体的制备过程
抗原4
第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
抗体检测
2. 单克隆抗体的制备过程
抗体检测呈阳性
第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞
抗体检测
2. 单克隆抗体的制备过程
第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞
使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
单克隆抗体
体内或体外培养
注射到小鼠腹腔
2. 单克隆抗体的制备过程
腹内培养相对于体外培养的优点：不需要特定的培养基，不需要严格控制环境条件。
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体
杂交细胞
杂交瘤细胞
体外或
体内培养
第一次筛选
骨髓瘤细胞
诱导融合
分泌特异抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞群
提取
已免疫的B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
特异性强
灵敏度高
可大量制备
注射抗原
单克隆抗体的制备过程
选择性培养基上培养
第二次筛选
克隆化培养抗体检测
既能大量繁殖又能产生专一抗体
单克隆抗体的制备小结
（1）该过程中应用到的技术_______________________________________
（2）原理_______________________________________
（3）注射特定抗原的目的______________________________________________
（4）诱导融合的方法______________________________________
动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
（5）第一次筛选的目的______________________
第一次如何筛选___________________________
筛选原理____________________________________________________
_____________________________
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
单克隆抗体的制备小结
（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________
（7）第二次筛选的目的________________________________________________
如何筛选_______________________________________ ____________
选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________ _____________
（8）抗体检测原理_______________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养___________________________
②小鼠腹腔内培养_________________________
（11）单克隆抗体的优点_____________________________
_________________________________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
阳
【资料1】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点：
3. 单克隆抗体的应用
作为诊断试剂——最广泛的应用
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
【资料2】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
3. 单克隆抗体的应用
用于治疗疾病和运载药物
讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
二、单克隆抗体技术及其应用
3. 单克隆抗体的应用
讨论2： 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
4.单克隆抗体的优点
（1）能准确地识别抗原的细微差异；
（2）与特定抗原发生特异性结合；
（3）可以大量制备。
5．单克隆抗体的应用
（1）广泛用作诊断试剂
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
（2）运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC）。
生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤。
(单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）直接用于治疗疾病。
二、单克隆抗体技术及其应用
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
C
练习与应用
一、概念检测
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
练习与应用
一、概念检测

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