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第二章 细胞工程
2.2.3 动物体细胞核移植技术和克隆动物
应用到的技术？
细胞膜具有一定的流动性
多种杂交细胞及未融合的细胞
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
诱导 融合
提取
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔
体外培养
大量单克隆抗体
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（能产生抗体）
（能无限增殖）
从腹水中提取
从培养液中提取
克隆化培养、抗体检测
（进行多次筛选）
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞增殖
单克隆抗体制备过程
原理？
复习回顾
一把毫毛
三二百个小猴
中国科学院神经科学研究所非人灵长类研究平台主任孙强及其团队的最新成果实现了这个场景。2018年1月25日，顶尖学术期刊《细胞》以封面文章在线发表了他们的成果：成功培育全球首个体细胞克隆猴。这意味着中国科学家成功突破了现有技术无法克隆灵长类动物的世界难题。
克隆
一般指DNA分子扩增
由一个细胞分裂所形成的细胞群体
指基因型完全相同的个体或群体
音译自“clone”，指由一个共同的祖先，通过无性繁殖产生一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。
知识拓展
DNA（分子）水平
细胞水平
个体水平
三个层次：
定义：
技术：
动物细胞克隆——
动物克隆——
植物克隆——
DNA克隆—— PCR技术
动物细胞培养
植物组织培养
？
我们能否利用类似植物组织培养获得完整植物体的方法培养动物细胞，使其发育成一个完整的个体？
不能，高度分化的植物细胞仍保持着全能性，而动物细胞的全能性会随细胞分化程度的提高逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。
因此，目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体，用动物体细胞克隆的动物，实际是通过核移植来实现的。
动物细胞核的全能性
将动物的一个细胞的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。
1.概念:
2.原理:
供体提供
一、动物细胞核移植技术
受体
3.生殖方式：
无性生殖
4.种类：
胚胎细胞核移植：
体细胞核移植：
细胞分化程度低，表现全能性容易
细胞分化程度高，表现全能性十分困难
①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其____前的功能状态，这导致了_____________；
胚胎发育率低
②对非人灵长类动物_____进行操作的技术尚不完善。
胚胎
分化
体细胞核移植的困难原因（非人灵长类动物）
请阅读课本53页，结合克隆高产奶牛的流程，分析、讨论以下问题：
体细胞和卵母细胞从哪里来？
卵母细胞需要在体外培养到什么时期？为什么？
在将供体细胞的细胞核移人卵母细胞前，需要先对卵母细胞进行什么操作？为什么？
注入去核的卵母细胞的是整个供体细胞还是供体细胞的细胞核？为什么？
诱导融合的方法？融合的结果？融合后的细胞可以直接发育成胚胎吗？
什么是重构胚？激活重构胚的方法？用这些方法处理重构胚的目的？
该过程用到了哪些动物细胞工程的技术手段？
5.动物体细胞核移植的过程
屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
“去核”的卵母细胞
供体细胞培养
通过显微操作去核
高产奶牛
（供体）
从供体身体的某一部位（如耳）上取体细胞
①细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；
②细胞体积大，便于操作；
③卵黄多，营养物质丰富。
卵母细胞的特点：
卵母细胞为什么要“去核”？
保证核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自供体细胞。
为什么要培养到MⅡ期？
正常排出的卵子即处于MⅡ期，此时卵母细胞已发育成熟，细胞质中具有激活重构胚以及早期胚胎发育的必需因子。
①对卵母细胞损伤较小；
②保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。
电融合法
激活方法：①物理方法；②化学方法
形成重构胚
为什么将整个供体细胞注入卵母细胞中？
激活重构胚目的是什么？
用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚胎，使其完成细胞分裂和发育进程。
早期胚胎
去核的卵母细胞
供体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
早期胚胎
(代孕)母牛体内
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
克隆牛
问题1 整个过程用了哪些技术？
问题2 新生牛的性别？性状表现与三个亲本都相关吗？
问题3 繁殖方式？
动物细胞培养、动物体细胞核移植、早期胚胎培养、胚胎移植
与供体相同，性状与代孕母牛无关
无性繁殖
1.你认为用上述体细胞核移植技术培育的克隆动物，是对体细胞动物进行了100%的复制吗？为什么？
不是。
①克隆动物绝大部分DNA来自供体动物的细胞核，但线粒体中的DNA（细胞质中的DNA）同时来自供体细胞和受体卵母细胞；
②环境也会影响克隆动物的性状，其环境与供体不完全相同；
③可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异。
2.体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应用前景的差异。
治疗性克隆 vs iPS细胞治疗
病人
取核
去核卵母细胞
重构胚胎
各种细胞组织或器官
诱导
取出
体细胞
核移植
移植
成纤维细胞
取出
转入相关因子
iPS细胞
各种细胞组织或器官
胚胎干细胞
取出
诱导
移植
治疗性克隆
iPS细胞治疗
细胞发生转化
利用体细胞核移植技术和诱导iPS细胞都能生成干细胞，但它们的过程是完全不同的。
①通过体细胞核移植技术可以生成带有核供体细胞遗传物质的胚胎干细胞；诱导iPS 细胞需要在细胞中表达几个关键基因，将细胞逆转到类似胚胎干细胞的状态。
②体细胞核移植技术对核供体细胞有较高要求，一般情况下体细胞的分化程度越高，它重编程为干细胞的成功率就越低；可诱导成为 iPS 细胞的细胞来源相对广一些，研究表明成纤维细胞、 B 淋巴细胞、脂肪干细胞等都可以诱导成为 iPS 细胞。
③体细胞核移植技术涉及采集卵母细胞、去核、融合等复杂的操作；诱导iPS 细胞的技术流程相对简单，可能更适合用于生产实践。目前科学家还在研究由这两种技术生成的干细胞在基因表达、 DNA甲基化等方面的差异，这些研究成果也将直接影响它们今后的应用。
体细胞核移植知识检测
1.采集的卵母细胞应培养至_____________________
2.选择MⅡ期卵母细胞的原因
①____________________________________
②_________________________
③_________________________
3.卵母细胞去核的方法_________________
4.“去核”去的是什么？________________________
5.去核的原因________________________________________________________
MⅡ期（减数分裂Ⅱ中期）
含有促进细胞核表现全能性的物质
细胞体积大，易于操作
显微操作（去核）法
纺锤体-染色体复合物
卵母细胞内卵黄多，营养物质丰富
使核移植得到的胚胎或动物核内遗传物质全部来自有重要利用价值的动物
6.供体细胞注入卵母细胞的优点 _____________________________
7.诱导融合的方法___________
8.融合的结果______________________________
9.重构胚概念_________________________________________
10.激活重构胚的方法
①物理方法_____________
②化学方法___________________________________
11.以上方法处理重构胚的目的 __________________________________________
12.实验结论__________________________________________________
对卵母细胞损伤较小
电融合法
供体核进入卵母细胞，形成重构胚
人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力
电刺激
Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂
激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性
早期胚胎培养
动物细胞培养
胚胎移植
动物细胞核移植
早期胚胎
激活重构胚
重构胚
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
通过显微操作 去核
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
从供体身体上取体细胞
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
1.应用前景
（1）在畜牧生产中
加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育
二、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
（2）在医药卫生领域：
①通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；
乳腺生物反应器
换成核移植过程相关细胞
（2）在医药卫生领域：
②在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体；
③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们一直给患者时可以避免免疫排斥反应。
（3）在科研领域：
①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；
②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；
③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。
（4）在保护濒危动物领域：该技术有望增加濒危物种的存活数量。
黑草黄弄蝶
白鳍豚
金丝猴
许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。易出现早衰（多利羊猜想）。
胚胎移植—动物幼体产出概率＜10％
(1)成功率低
(2)克隆动物存在健康问题
(3)克隆动物食品的安全性问题存在争议
2.存在的问题
一些研究者认为，克隆动物的端粒比较短，基因表达不正常，早衰是一种必然现象。另一些研究者则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中的一些技术问题造成的；或者克隆动物在发育过程中出现了变异，早衰只是偶然现象。
拓展
“多莉”只存活7年，远低于平均的12岁
1. 假设世界上最后一头野驴刚死亡，以下使它"复生"的方案中可行的是（ ）
A. 将野驴的基因导入家驴的受精卵中，培育出新个体
B. 将野驴的体细胞取出，利用组织培养培育出新个体
C. 将野驴的体细胞两两融合，再经组织培养培育出新个体
D. 将野驴的体细胞核移植到家驴的去核卵母细胞中, 经孕育培育出新个体
D
一、概念检测
练习与应用（P55）
2. 2017年，某国批准了首例使用细胞核移植技术培育"三亲婴儿"的申请。其培育过程可选用如下技术路线。据图分析下列叙述错误的是（ ）
C
A. 该技术涉及动物细胞培养、细胞核移植等操作
B. 该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代
C. 卵母细胞捐献者携带的红绿色盲基因能够遗传给"三亲婴儿"
D. "三亲婴儿"同时拥有自己父亲、母亲及卵母细胞捐献者的部分基因
练习与应用（P55）
一、概念检测
1. 大熊猫是我国的国宝。尽管我国政府采取了许多保护措施，但由于大熊猫的繁殖能力低，幼仔成活率也低，它的数量仍然非常少。有科学家尝试采用体细胞核移植技术来克隆大熊猫。请你结合本节所学内容并搜集相关资料了解这方面的研究进展。也有人不赞成进行克隆大熊猫的研究，认为保护大熊猫的最好措施就是保护现有大熊猫及其生存环境, 对此你有什么看法？
提示：是否赞成克隆大熊猫，只要言之有理，无论赞成还是反对克隆大熊猫的研究，都应该保护好大熊猫的生存环境，否则即使成功克隆了大熊猫，它们没有适宜的生存环境，也可能走向灭绝。
二、拓展应用
练习与应用（P55）
2. 2003年，世界上第一只用体细胞克隆的动物——多莉，因患有严重的肺部疾病被实施了安乐死。它只活了7岁，而普通绵羊的平均寿命在12岁左右。多莉的死亡引发了关于克隆动物是否早衰的争论。一些研究者认为，克隆动物的端粒比较短，基因表达不正常，早衰是一种必然现象。另一些研究者则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中的一些技术问题造成的;或者克隆动物在发育过程中出现了变异，早衰只是偶然现象。请你搜集资料，寻找支持各方观点的研究证据。你也可以调查克隆动物存在的其他问题，并说明科学家是如何解决这些问题的。
提示：在搜集证据的过程中，要注意证据的来源及其真实性和可靠性，虽然目前对克隆动物的早衰问题存在争论，但这样的争论有利于人类进一步了解生命现象，也有利于克隆技术更好地应用于医疗、农牧业等领域。
二、拓展应用
练习与应用（P55）
课后拓展
你支持克隆人吗？

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