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第1章 发酵工程
第2节 微生物的基本培养技术及应用第2课时 微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
稀释涂布平板法
呈现的杂菌群
从社会中来
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
美国黄石公园
那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
一. 选择培养基
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2. 筛选原则
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
有利于目的菌生长的条件有哪些？
营养、温度和pH等
一. 选择培养基
概念:在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源水生栖热菌酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自养型微生物固氮菌一.选择培养基3.选择培养基类型:
培养基中加青霉素
具有青霉素抗性的菌落
培养基应有菌落
没有青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗青霉素能力的细菌
一. 选择培养基
01
尿素的立体结构
【思考·讨论】
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。
尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
一. 选择培养基
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
【思考·讨论】
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
问
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
问
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4 ·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是______________________；该类培养基的主要用途为_____________________________。
2.从用途上来讲， 属于选择培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有：
。
培养基一的主要碳源为 ，
主要氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数、保存
培养基二
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
现学现用
02
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
主要过程:
A.梯度稀释菌液 B.涂布平板
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
稀释涂布平板法
二. 微生物的选择培养
02
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
微量
移液器
①铲取土样，将样品装入纸袋中
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
（1）梯度稀释
稀释涂布平板法
二. 微生物的选择培养
02③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。（2）涂布平板稀释涂布平板法二.微生物的选择培养02恒温培养箱稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。（3）菌落培养与观察稀释涂布平板法二.微生物的选择培养 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度
和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
A
B
C
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
一般来说，在相同的培养条件
下，同种微生物表现出稳定的菌落
特征，如形状、大小和颜色等。
02
稀释涂布平板法
二. 微生物的选择培养
（3）菌落培养与观察
主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法
主要步骤 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线
接种工具 涂布器 接种环
菌体获取 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
能否用于计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。 比较稀释涂布平板法和平板划线法
03
方法一：稀释涂布平板法
方法二：显微镜直接计数法
——间接计数法
——直接计数法
三. 微生物的数量测定
方法一：稀释涂布平板法（活菌计数法）
阅读教材P18，回答下列问题：
1.为什么通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数？
2.统计菌落数目时，选择菌落数范围为多少的平板？
3.在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数求平均值的原因是什么？
4.统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是什么？
在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
30—300
重复实验
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
03计算公式:每g样品中的菌落数＝(C÷V)×MM代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)例：某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )A. 2.34×108B. 2.34×109C. 234 D. 23.4（234÷0.1）×106=2.34×109答B例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1× 105=9 ×107个三.微生物的数量测定方法一：稀释涂布平板法（活菌计数法）两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
实例分析：
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
三. 微生物的数量测定
03血细胞计数板：细菌计数板：常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。对细菌等较小的细胞进行观察和计数。缺点：①不能区分死菌和活菌→偏大②不适于对运动细菌的计数。③个体小的细菌在显微镜下难以观察。优点：快速、直观03三.微生物的数量测定方法二：显微镜直接计数法内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M
　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数
缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
微生物的计数方法比较
(1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基(　　)
(2)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源(　　)
(3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量(　　)
×
√
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨。
×
利用显微镜直接计数法统计的细菌数量无法区分死菌和活菌。
判断正误 P11
1.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是
典题应用 P14
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的能力
√
2.如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是

A.图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
√
1.提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。
2.做出假设
3.实验设计
实验步骤
土壤
取样
制备
培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意
实验步骤
（1）土壤取样
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
对照作用
思考1.为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
（2）培养基的制备
实验步骤
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
（3）样品的稀释
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
实验步骤
（4）样品的稀释与涂布平板
1）每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基（ 实验），
4为 培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；
2）另外，整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的 。
培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
4
重复
牛肉膏蛋白胨
2
选择培养基和牛肉膏蛋白胨
实验步骤
①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
②每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
（5）微生物的培养与观察
实验步骤
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
鉴定培养基
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
选择培养基与鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别目标微生物
培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
四. 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
(1)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同(　　)
×
判断正误 P14
(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　　)
(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据(　　)
√
×
当两个或多个菌落连在一起时，只能观察计为一个菌落，因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。
3.(多选)下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，正确的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后会
使酚红指示剂变红
√
√
典题应用 P16
4.(2023·江苏连云港高二期末)在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了
问题
B.将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，
可以证明培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，
则可以证明甲同学无误
D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
√
下节课见！

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