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(共44张PPT)
第1节
重组DNA技术的基本工具
第3章　基因工程
人教版高中生物 选择性必修3
学习目标
1.通过资料分析，阐明基因工程的理论基础。
2.通过模拟制作活动，阐明限制酶、DNA连接酶和载体的作用。
3.通过了解基因工程的发展历程，认同基因工程的诞生和发展离不开多个学科的理论研究和技术创新。
情境视频
抗虫棉
抗虫棉
情境视频
棉花细胞
普通棉花
(无抗虫特征)
(含抗虫基因)
棉花植株
(有抗虫特征)
基因工程
抗虫基因
提取
苏云金芽孢杆菌
(有抗虫特征)
基因工程的概念和工具酶
一
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
二
目录
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
基因工程的建立过程
一
基因工程的概念和工具酶
一
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。
主要在生物体外
基因（DNA）
DNA分子水平
创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
基因重组
定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限
基因工程的概念
别名：
操作环境：
操作对象：
操作水平：
结果：
原理：
特点：
【归纳定义】
重组DNA技术、转基因技术
基因工程的理论基础
任务一
1．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
减数分裂I前期，同源染色体上非姐妹染色单体间的互换；
减数分裂I后期，非同源染色体上非等位基因的自由组合。
基因工程的理论基础
任务一
2. 为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
3. 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
在培育转基因抗虫棉时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入棉花体内，并使其表达。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
一
基因工程的概念和工具酶
一
主要是从原核生物中分离纯化来的
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
磷酸二酯键
限制性内切核酸酶（限制酶）
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子手术刀”
1
来源：
2
作用：
限制酶名字的由来
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
资料卡
EcoRI 限制酶
大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别____________序列，并切割_____和_____之间的______________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
当限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
中轴线
3
结果：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子手术刀”
5'
5'
3'
3'
黏性末端
限制酶
SmaI 限制酶
SmaI 限制酶只能识别 序列，切割 和 之
间的 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
当限制酶在它的识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端
中轴线
3
结果：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子手术刀”
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
不能。
可断开2个磷酸二酯键；
产生2个游离的磷酸基团；
产生2个黏性末端；
消耗2分子水。
限制酶只能识别并切开双链DNA分子
酶的专一性
(2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？
产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
核心归纳
回文序列
EcoRⅠ
SamⅠ
特点1：都可以找到一条中（心）轴线；
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
2.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
3. 为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
思考：你从中发现什么规律？
4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
SpeⅠ：　　　　HindⅢ：　　　　XbaⅠ：　　　　XhoⅠ：
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
同种限制酶产生的黏性末端相同。不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
同尾酶
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
限制酶XbaⅠ。因为限制酶XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
不能再被所用的限制酶识别；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
判断正误
(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种(　　)
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)
(3)DNA连接酶能将两个碱基通过氢键连接起来(　　)
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(　　)
×
×
√
×
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
G
G
C T T A A
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
一
基因工程的概念和工具酶
一
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
02
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子缝合针”
DNA连接酶
1
作用：
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
种类 ___________________
___________________
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端
（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子缝合针”
2
种类：
02
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子缝合针”
T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
旁栏思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键
DNA聚合酶作用示意图：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子缝合针”
核心归纳
与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 限制酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 单个的脱氧核苷酸 DNA DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成重组DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 切割DNA分子形成黏性末端或平末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
跟踪训练
1．以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
√
跟踪训练
限制酶主要来自原核生物，DNA连接酶主要来自大肠杆菌和T4噬菌体，A错误；
限制酶都能在特定位点切割产生黏性末端或平末端，C错误；
DNA连接酶与DNA聚合酶作用的底物不同，前者作用的底物是两个DNA片段，后者作用的底物是单个脱氧核苷酸，D错误。
2.(2023·吉林长春高二期中)下列关于限制酶和DNA连接酶的叙述，正确的是
A.两者都是从原核生物中分离纯化出来的
B.两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变
C.限制酶都能在特定位点切割产生黏性末端
D.DNA连接酶与DNA聚合酶作用的底物是相同的
√
基因工程的概念和工具酶
一
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
二
目录
一
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
二
质粒
将外源基因送入受体细胞。
动植物病毒
噬菌体
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
大肠杆菌及质粒结构模式图
裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
1
作用：
2
种类:
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
载体——“分子运输车”
载体需具备的条件和载体的选择
任务三
1．载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
　
2．要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
载体需要具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
载体能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中稳定存在，不至于丢失。
3．我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
载体需要具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
核心归纳
1. 标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
核心归纳
2．如何提高筛选的准确性
当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
大肠杆菌及质粒结构模式图
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
有一个至多个限制酶切割位点
具有特殊的标记基因
无毒害作用
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
可携带多个或多种外源基因
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
3
载体需具备的条件:
一
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
二
载体需具备的条件和载体的选择
任务三
4．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
5．若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
这种说法合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
判断正误
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　)
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体(　　)
(3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同(　　)
(4)重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体(　　)
×
×
√
×
跟踪训练
3.(2023·江苏淮安高二联考)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是
A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B.在所有的质粒上总能找到一个至多个限制酶切割位点
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会
随后者的复制而复制
D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA分子的筛选
√
跟踪训练
质粒不只分布于原核生物中，在真核生物(如酵母菌)细胞内也有分布，A错误；
并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点从而成为适合运载目的基因的工具，B错误；
重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上，随受体DNA同步复制，C错误。
跟踪训练
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
跟踪训练
A.①是c；②是b；③是a
B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a
D.①是c；②是a；③是b
√
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
跟踪训练
第①组：细菌在含氨苄青霉素和四环素的培养基上都能生长，说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因均没有被破坏，外源基因插入的位置是c；
第②组：细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含四环素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，四环素抗性基因被破坏，外源基因插入的位置是b；
第③组：细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因没有被破坏，外源基因插入的位置是a。综上所述，A正确。
课堂小结

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