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(共41张PPT)
第1课时　
目的基因的筛选与获取、
基因表达载体的构建
第3章　基因工程
人教版高中生物 选择性必修3
第2节　基因工程的基本操作程序
学习目标
1.阐明PCR的原理，说出PCR反应所需的条件和PCR反应的过程。
2.说出基因表达载体的组成。
情境导入
转基因抗虫棉
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
一
基因表达载体的构建
二
目录
一
目的基因的筛选与获取
一
1.目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
导入
抗虫棉
培育
棉花细胞
1
概念：
2
实例：
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子
（1）从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
（2）利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。
Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。
一
目的基因的筛选与获取
一
2.筛选合适的目的基因
方法：
前提：
方法：
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
DNA合成仪
蛋白质的
氨基酸序列
mRNA的
核苷酸序列
基因的
核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
一
目的基因的筛选与获取
一
3.获取目的基因的方法
1
人工合成目的基因
2
通过构建基因文库来获取目的基因
3
常用PCR特异性地快速扩增目的基因
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
DNA半保留复制
穆里斯
解旋
合成子链
复旋
一
目的基因的筛选与获取
一
4.利用PCR获取和扩增目的基因
1
概念：
2
原理：
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
四种脱氧核苷三磷酸
（dNTP））
DNA模板
引物
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
PCR仪
3
基本条件：
4.利用PCR获取和扩增目的基因
引物
4.利用PCR获取和扩增目的基因
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。
用于
四种脱氧核苷三磷酸
（dNTP））
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
四种脱氧核苷三磷酸
（dNTP））
DNA模板
引物
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
PCR仪
3
基本条件：
4.利用PCR获取和扩增目的基因
四种脱氧核苷三磷酸
（dNTP））
4.利用PCR获取和扩增目的基因
A
T
C
G
P ~ P ~ P
脱氧核糖
含氮碱基
磷酐键
脱氧核苷酸
dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下：
一定量的模板DNA
引物
4中脱氧核苷酸dNTP
缓冲液
热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
Mg2+
作为DNA复制的模板
使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
作为合成DNA子链的原料
提供相对稳定的pH环境
催化合成DNA子链
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活
4.利用PCR获取和扩增目的基因
3
基本条件：
当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
变性
延伸
复性
4.利用PCR获取和扩增目的基因
4
PCR反应过程：
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
变性
90℃以上
延伸
72℃左右
复性
50℃左右
基本过程
4.利用PCR获取和扩增目的基因
5
PCR的结果：
6
PCR产物的鉴定：
PCR扩增技术
任务一
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。
不是完整的模板DNA分子；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
PCR扩增技术
任务一
2. 图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
第3轮；1/4。
PCR扩增技术
任务一
4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。
第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
PCR扩增技术
任务一
5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
共需消耗2n－1对引物。
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
第1次
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
第2次
3’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
第3次
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
第4次
1个
3个
4个
1个
3个
4个
PCR扩增技术
任务一
PCR扩增技术
任务一
PCR扩增技术
任务一
PCR中的数量关系小结
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
跟踪训练
1.(2023·山西太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
√
目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。
2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是
A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧
核苷酸连接到3′端
B.在第三轮循环产物中开始出现两条
脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，
则不能有效扩增目的基因
D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
跟踪训练
√
跟踪训练
由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的DNA分子是7个，即占7/8，D错误。
目的基因的筛选与获取
一
基因表达载体的构建
二
目录
一
基因表达载体的构建
二
苏云金杆菌中的Bt基因
普通棉花细胞
含Bt基因的棉花细胞
能产生Bt抗虫蛋白的棉花植株
转入
植物组织培养技术
形成
使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
基因工程的核心工作
1
目的：
获取Bt基因后能不能直接将它导入受体细胞呢？
一
基因表达载体的构建
二
2
组成：
DNA复制的起始位点
位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
位于基因的下游；终止转录
便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
能控制表达所需要的特殊性状
分析基因表达载体构建的目的和方法
任务二
启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，
目的基因才可以正常表达。
2.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？
① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。
② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
载体
基因表达载体
一
基因表达载体的构建
二
3
构建过程：
分析基因表达载体构建的目的和方法
任务二
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
3.请结合下图，回答问题：
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
分析基因表达载体构建的目的和方法
任务二
（2）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、
外源DNA的优点是什么？
3.请结合下图，回答问题：
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
核心归纳
1．限制酶的选择
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
核心归纳
1．限制酶的选择
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
核心归纳
1．限制酶的选择
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
核心归纳
1．限制酶的选择
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
核心归纳
2.区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子
名称 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束
拓展延伸
启动子的类型
根据启动子的转录模式，可分为：
①组成型启动子 能够调控基因的表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。
②组织特异性启动子 其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。其最大的优势是其启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加了转基因的效果。
③诱导型启动子 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
跟踪训练
√
3.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA
连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用
T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用
T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
4.(2023·湖北，4改编)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。
下列叙述错误的是
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，
不一定含有目的基因
C.若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中
能形成菌落
跟踪训练
√
课堂小结

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