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(共46张PPT)
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括 及一些 等。
本章提及的微生物主要指用于发酵的 。
一.微生物概述
（P9右下角相关信息）
细菌、真菌、病毒
原生生物
细菌和真菌
微生物的培养技术包括那些过程呢？
纯培养的步骤
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
二.微生物纯培养的技术的步骤述
基础
二.微生物纯培养的技术的步骤述
（一）培养基的配置
任务1：请同学们自主阅读教材P9-10，完成以下问题：
1.培养基的概念？作用？
2.培养基的类型？实验室最常用的培养基？
3.培养基的营养构成？如何满足不同微生物的特殊需求？
人们按照__________________________，配制出供其生长繁殖的营养基质，即培养基。
1.概念：
微生物对营养物质的不同需求
2.作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或
积累其代谢物。
二.微生物纯培养的技术的步骤述
（一）培养基的配置
实验室常用培养基之一
固体培养基
液体培养基
加入凝固剂（如琼脂）
分离、鉴定、计数和菌种保存等。
扩大微生物种群数量
琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
菌落
单个微生物在培养基表面或内部形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
一个菌落就是一个种群
二.微生物纯培养的技术的步骤述
（一）培养基的配置
3.类型
（1）根据物理性质分
01菌落是鉴定菌种的重要依据。不同菌落的大小，形状，光泽度，硬度等不同细菌放线菌霉菌二.微生物纯培养的技术的步骤述菌落湿润，光滑，透明和粘稠，质地均匀较小，干燥，不透明，表明呈致密的丝绒状，上面有一薄层彩色“干粉”较大，干燥，不透明，质地疏松，呈现蛛网状，绒毛状或棉絮状
二.微生物纯培养的技术的步骤述
资料分析
1.青霉菌能抑制细菌的生长，对真菌没有作用，怎样从含
有混合菌种的培养基中选择出真菌
真菌菌落
培养基
培养基中加青霉素
细菌落被淘汰
培养基+青霉素
真菌和细菌菌落
二.微生物纯培养的技术的步骤述
资料分析
2.当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，细菌带正电荷，与
伊红染色，再与美蓝结合生成紫褐色化合物，大肠杆菌菌
落则形成紫黑色带金属光泽的小菌落，而产气杆菌则形成
棕色大菌落。不能发酵乳糖的细菌产碱性物较多，带负电荷
与美蓝结合，被染成蓝色菌落。
1.根据以上信息如何配置培养基鉴别出培养基中的大肠杆菌？
向培养基中加入伊红—亚甲基蓝
2.资料1和资料2中分别说明了培养据有什么作用？
二.微生物纯培养的技术的步骤述
资料分析
2.当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，细菌带正电荷，与
伊红染色，再与美蓝结合生成紫褐色化合物，大肠杆菌菌
落则形成紫黑色带金属光泽的小菌落，而产气杆菌则形成
棕色大菌落。不能发酵乳糖的细菌产碱性物较多，带负电荷
与美蓝结合，被染成蓝色菌落。
选择和鉴别菌种的作用
2.资料1和资料2中分别说明了培养据有什么作用？
二.微生物纯培养的技术的步骤述
（一）培养基的配置
3.类型
（2）根据作用分
选择培养基：
用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。
设计选择培养基时，主要考虑某些微生物的特殊营养需求或它们对某些化学物质的抗性。
鉴别培养基：
用来鉴别不同类型的培养基。
设计鉴别培养基时，主要考虑某些微生物的代谢物与加入的某种特殊的化学物质发生反应时，产生明显的特征性变化，根据这种特征性的变化，就可以将该种微生物与其他微生物区分开来。
采用__________培养基培养，大肠杆菌的菌落呈现____色。
伊红美蓝
黑
以_____为惟一_____的培养基对土壤中的分解尿素的细菌进行筛选。
氮源
尿素
当需要酵母菌和霉菌时，可以在培养基中加入青霉素，以抑制细菌和放线菌的生长，从而分离出酵母菌和霉菌；在培养基中加入高浓度的食盐溶液可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，可以将金黄色葡萄球菌分离出来。
通常在培养基中加入______指示剂，培养分离出的细菌，若指示剂变____，可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。因为分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，使培养基的pH______。
酚红
红
升高
鉴别培养基
选择培养基
鉴别培养基
选择培养基
二.微生物纯培养的技术的步骤述
二.微生物纯培养的技术的步骤述
（一）培养基的配置
3.类型
（3）根据化学成分分
请分析资料一和资料二中两种培养基在化学成分来源上的区别是什么？
资料一：利用成熟的马铃薯和普通的牛肉汤，可以分 别用于培养霉菌和细菌。
资料二：高氏一号培养基用来培养放线菌，如图为该培养基的成分：
资料一中培养基成分为化学成分不明确的 天然物质，资料二中培养基成分是用已知的化学物质配置的
天然培养基
由天然物质制成
合成培养基
由人工合成的，组分明确
高氏一号培养基
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
总结培养基的类型及用途3+2P8
014.培养基的营养成分:（1）基本成分：碳源无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等自养微生物异养微生物功能：①构成细胞物质和一些代谢产物②有机碳既是碳源又是能源。氮源无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3、N2等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。无机盐功能：提供无机营养调节pH维持渗透压水功能：良好的溶剂维持生物大分子结构的稳定（一）培养基的配置二.微生物纯培养的技术的步骤述（2）特殊条件：pH、O2和特殊营养物质例：1、培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；2、培养霉菌时，需要将培养基调制酸性；3、培养细菌时，需要将培养基调制中性或弱碱性；4、培养厌氧微生物时，需要提供无氧条件014.培养基的营养成分:生长因子、氨基酸、维生素、碱基等（一）培养基的配置二.微生物纯培养的技术的步骤述培养基成分 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 氢元素、氧元素
牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）
牛肉膏
蛋白胨
牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。
蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂。一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。
二.微生物纯培养的技术的步骤述
（一）培养基的配置
4.培养基的营养成分:
【典例】下表是牛肉膏蛋白胨培养基的配方，分析回答：
材料 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 定容至1 000 mL
(1)根据培养基的物理性质，该培养基属于________培养基，理由是_____________________________________________________________。
(2)该培养基中主要提供碳源和氮源的物质分别是什么？属于有机物还是无机物？________________________________________________________。
(3)该培养基培养的微生物同化作用类型是_____________，理由是_________________________________________________________。
固体
该培养基的配方中含有凝固剂琼脂
牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。二者均属于有机物
异养型微生物　
该微生物的碳源和氮源是有机物
微生物培养基是否都需要人工添加碳源或氮源？
培养基不一定都要人工添加碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源。
5.培养基的配制原则
(1)目的要明确：不同微生物需求不同，根据微生物的种类、培养目的进行配制。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜：不同微生物适宜生长的pH范围不同，可在培养基中添加缓冲剂维持pH稳定。　　　
（一）培养基的配置
二.微生物纯培养的技术的步骤述
【基础过关】
(1)所有的培养基中都要加入琼脂。( )
(2)是碳源的物质不可能同时是氮源 。( )
(3)培养霉菌时一般需将培养基调至碱性。( )
(4)培养厌氧型微生物时，除需要提供无机碳源之外，还需要提供无氧的条件。( )
×
×
×
×
(5)凡碳源都提供能量。（ ）
(6)除水以外的无机物只提供无机盐。（ ）
(7)无机氮源也可能提供能量。（ ）
(8)培养基只能用于培养微生物。（ ）
×
×
√
×
提示：培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件，其碳源的类型要看其同化作用类型，若为自养型则需要提供无机碳源，若为异养型则需要提供有机碳源。
二.微生物纯培养的技术的步骤述
（二）无菌技术
任务2：请同学们自主阅读教材P10-11，完成
以下表格：
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
02类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物。强烈的理化方法，杀死所有微生物。煮沸消毒家庭餐具等生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒牛奶等不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体（皮肤、伤口）、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基及多种器材和物品高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121 ℃,15～30min接种室、接种箱，超净工作台（迅速彻底）二.微生物纯培养的技术的步骤（二）无菌技术芽孢是某些细菌在营养条件缺乏时，在菌体内形成的含水量低、抗逆性强的休眠体；孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。1.概念：
_____________的培养微生物的操作技术。
2.防止杂菌污染手段：
主要包括____和____。
（1）对实验操作的____、操作者的________，进行清洁和消毒。
（2）将用于微生物培养的____、________和______等进行灭菌。
防止杂菌污染
消毒
灭菌
空间
衣着和手
器皿
接种用具
培养基
思考：无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
还能有效避免操作者被微生物感染。
超净工作台
二.微生物纯培养的技术的步骤
（二）无菌技术
生物消毒法P10相关信息
02 还要注意：避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触；为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。二.微生物纯培养的技术的步骤（二）无菌技术 某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下；然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下；将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养 24h 后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
【应用探究】
（1）这个材料中哪些材料用具需要灭菌处理？
（2）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上的微生物的污染？
培养皿、培养基
不能
用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行
(1)获得纯净的微生物培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。( )
(2)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底。( )
(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。( )
提示：培养基通常采用高压蒸汽灭菌，而接种环则采用灼烧灭菌。
(4)培养基最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。( )
（5）接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌。 （ ）
（6）在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，防止被微生物感染。 （ ）
（7）使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。（ ）
√
√
×
√
【基础过关】
×
√
√
03
【探究 实践P72】
(三) 酵母菌的纯培养
1.实验原理：
2.获得单菌落的方法:
①平板划线法 ②稀释涂布平板法
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
二.微生物纯培养的技术的步骤
03
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
制备培养基
灭菌
倒平板
配制培养基
二.微生物纯培养的技术的步骤
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃
薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用
蒸馏水定容至1000ml（定容）。
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用
皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为
121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几
层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
①拔出锥形瓶的棉塞
②将瓶口迅速通过火焰
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
3.操作步骤
思考讨论：
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。为什么？
你用什么办法来估计培养基的温度？
倒平板时高于50℃会烫手，低于50℃若不即使操作，琼脂会凝固。
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
03
（三）酵母菌的纯培养
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
制备培养基
灭菌
倒平板
配制培养基
二.微生物纯培养的技术的步骤
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。方法：平板画线法
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
③试管口通过火焰
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
平板划线法的具体操作：
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线
“平板划线法”实验操作
（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
思考讨论：
⑵在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
⑶在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌，划线结束后也要灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
（3）平板划线法注意事项
分区划线法（最常用）
（4）平板划线法中，三种灼烧接种环操作的目的
连续划线法
03
（三）酵母菌的纯培养
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
制备培养基
灭菌
倒平板
配制培养基
二.微生物纯培养的技术的步骤
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。方法：平板画线法
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的
平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的
恒温培养箱中培养24～48h。
1：为什么要将平板倒置？2：为什么要同时放入未接种的平板？既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染思考讨论：（2）在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
4.结果分析与评价
（1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
二.微生物纯培养的技术的步骤
（三）酵母菌的纯培养
（3）你是如何记录实验结果的？
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等。
4.结果分析与评价
二.微生物纯培养的技术的步骤
（三）酵母菌的纯培养
纯培养物
培养物
纯培养
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体
获得纯培养物的过程
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
纯培养的步骤：
二.微生物纯培养的技术的步骤
（四）酵母菌的纯培养P11
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物
研究和应用微生物的前提（也是发酵工程的重要基础）P10
微生物的接种，分离和培养
无菌技术
培养基的配制
一方面要为人们需要的微生物提供 ；另一方面要确保 ，并将需要的 。
实验室培养微生物有什么要求呢？
合适的营养和环境条件
其他微生物无法混入
微生物分离出来
评估论点的可信程度
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
一、概念检测
1.判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
①干制：降低食品的含水量；
②腌制：食盐、糖等制造高渗环境，抑制微生物的生长和繁殖；
③低温储存：降低微生物的代谢速率从而抑制微生物的生长和繁殖。
P14 练习与应用
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请回答：
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于哪一步操作？
（3）洗手后我们就能进行无菌操作了吗？
操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物
通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
P14 练习与应用
2. 将野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如图。请分析：
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。
二、拓展应用
P14 练习与应用

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