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(共26张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
从社会中来
我国自上世纪80年代起就使用菊酯类农药杀灭棉铃虫。但到了1992年，棉铃虫产生了极强的耐药性，可以在农药中游泳，鸡吃虫却被毒死，从过量撒药到人工捉虫，传统手段已经对棉铃虫束手无策，不仅农民收成全无，还产生了大量农药中毒的例子，这时候我们把目光转向了新型的生物技术--转基因抗虫棉。
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
思考：
1.转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗
2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
通过实验将细菌的“杀虫基因”转到棉花里，产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
P77
①目的基因的筛选与获取
②基因表达载体的构建
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的筛选与获取
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
1.目的基因
2.目的基因的筛选方法
（1）从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。（较为有效的方法）
如科学家知道苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关并掌握了Bt基因的序列信息；Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响。
（2）利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。
一、目的基因的筛选与获取
3.目的基因的获取
（1）从基因文库中获取
概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
分类：①基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
②cDNA文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
cDNA：先由mRNA在逆转录酶作用下获得单链DNA，再利用DNA聚合酶，将单链DNA复制，产生双链DNA，即为cDNA。
（2）人工合成法
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成。
（3）利用PCR(特异性)扩增目的基因（常用）
阅读P77，获取PCR的定义、条件、大致过程。
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建
基因组文库的构建
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶催化
DNA聚合酶催化
部分基因文库（如cDNA文库）构建
构建
PCR（聚合酶链式反应）
1.原理：
DNA半保留复制
2.条件：
模板（目的基因）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ )
3.过程：
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
PCR（聚合酶链式反应）
PCR（聚合酶链式反应）
4.优点：
可以在短时间内大量扩增目的基因
PCR技术与DNA复制过程比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原则
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
思考·讨论
(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
(2)经过第几轮扩增后，循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段？
比例是多少？
3
1/4
(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
补充——引物设计原则P77：
1.长度适当（20-30bp）；
2.引物内部不发生碱基互补配对；
3.引物之间不发生碱基互补配对；
4.GC含量适宜。
知识回顾
（1）PCR的概念: PCR是__________________的缩写，是一项根据__________________的原理，在______提供参与DNA复制的__________与_________，对________________________进行__________的技术。
反应条件
聚合酶链式反应
体外
各种组分
目的基因的核苷酸序列
大量复制
DNA半保留复制
（2）扩增过程: 目的基因DNA___________后解为单链，_____与单链相应互补序列结合；然后以__________为模板在______________作用下进行______，即将4种____________加到_____________，如此重复循环多次。
受热变性
引物
延伸
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
每次循环一般可以分为_______、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
P79·用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
cDNA
4种脱氧核苷酸【实际上是4种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）】，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量
引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
【课堂练习】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。
【课堂练习】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
5
引物甲、引物丙
62个引物=形成62条新单链=31个新DNA，加上原有的模板DNA，现在一共有32个DNA，即复制5次的结果。
PCR中的数量关系
①n代后，DNA分子有_____个；
②n代后，DNA链有_____条；
③第____代出现完整的目的基因；
④n代后，含引物的DNA分子有_____个；
⑤n代后，共消耗________个引物；
⑥第n代复制，消耗了______个引物；
⑦n代后，完整的(等长）目的基因有_______个。
第1代
第2代
第3代
第4代
2n
2n+1
3
2n
2n+1-2
2n
2n-2n
解析：等长目的基因=总DNA数-不等长的
不等长的=（长链·中链）+（中链·短链）
中链数每次循环增加两个，共2n个
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理：
DNA的热变性原理;DNA半保留复制的原理。
2.DNA片段的扩增过程：
移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
(4)如何对PCR产物进行鉴定？
琼脂糖凝胶电泳P84
必修二P52
DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
最长
最短
琼脂糖凝胶电泳演示实验
制备凝胶
①融化
②倒模
③凝固
用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
①加液
②加样
③电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
2.DNA片段的电泳鉴定过程
P85·1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
P85·2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？
（2）如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：模板DNA出现污染; Taq DNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体; Mg2+浓度过高;退火温度(复性时的温度)过低; 等等。
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
(M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；)
DNA标准样液
(Marker)
阳性
对照
阴性
对照
待测样品
阴性对照：用于检测是否存在含有其他序列的DNA污染。
模板DNA的制备
引物的质量与特异性
酶的质量
PCR循环的条件
(1)未出现扩增条带可能的原因有:模板DNA含有杂蛋白；Taq DNA聚合酶失活；引物出现质量问题；引物浓度不合适；Taq DNA聚合酶的抑制剂；Mg2+浓度过低;变性温度过低;变性时间过短;目的序列改变;等等。
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
（四）注意
课本P85
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
1.基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因+ 复制原点
（1）启动子：
（2）终止子：
（3）标记基因：
（4）复制原点：
一段有特殊序列结构的DNA片段；
①本质：
②位置：
位于基因的上游，紧挨转录的起始位点；
③功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
一段有特殊序列结构的DNA片段；
①本质：
②位置：
位于基因的下游；
③功能：
使转录在所需要的地方停下来
作用：
便于重组DNA分子的筛选
DNA复制开始的地方，使能完成自主复制
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 ______ _____ _______ _______
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 ________________________________________________ ____________________________ _____________________ ________________________
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
3.基因表达载体的构建过程
载体
基因表达
载体
（1）原核生物基因
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
终止子：终止转录
4.基因的结构
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
（2）真核生物基因
1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？
2.以上情况如何解决？
3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
4.以上情况如何解决？
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
思考
当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：
P80旁栏思考：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便么？如果这样做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。
思考·讨论
使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。

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