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(共30张PPT)
3.1 重组DNA技术的基本工具
怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？
棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
关键步骤一：
抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来
关键步骤二：
抗虫基因与棉花DNA“缝合”
关键步骤三：
抗虫基因进入棉花细胞
“分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
1
“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（简称限制酶）：
1.来源：
2.功能：
3.作用的化学键：
磷酸二酯键
主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
识别双链DNA特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
磷酸二酯键
原核生物
（专一性）
EcoRⅠ
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
5’
3’
磷酸二酯键
限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
课P71
5、作用结果：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶(EcoRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开
键,形成 末端。
-GAATTC-
-CTTAAG-
G
A
黏性
磷酸二酯
EcoR I
5'
5'
3'
3'
黏性末端
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出（未配对）的核苷酸，这样的切口叫黏性末端。
1
“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（简称限制酶）：
5、作用结果：
Sma I
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶(SmaⅠ)能识别 序列,并在 和 之间切割形成 ___末端 。
-CCCGGG-
-GGGCCC-
G
C
平
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
作用结果:
形成黏性末端和平末端
1
“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（简称限制酶）：
1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
破坏外源DNA，保护自我
2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
缺乏特定的核苷酸序列
1
1
“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（简称限制酶）：
请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
5’
A
T
G
C
T
A
C
G
3’
5’
3’
2
2
2
2
2.作用：
将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。
双链DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
1.概念：
能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。
两个DNA片段
3.种类和差别：
类型
来源
功能 只缝合____________ 缝合_________和_________________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率较低)
磷酸二酯键
E.coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
2
“分子缝合针”——DNA连接酶
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用
解旋酶
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
几种酶作用的图解
1.作用：
①携带目的基因进入受体细胞
②使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子
载体携带启动子和终止子。
3
“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
⑵种类：
思考题：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，
其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
⑴作用：
①将目的基因送入受体细胞
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
3
“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
⑶载体需具备的条件
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
3
“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
扩展：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：
也可以用荧光蛋白基因做标记
载体的作用
载体的
必要条件
载体的种类
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
②具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。
④必须是安全的 ，对受体细胞无害。
①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①细菌的质粒
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
【阅读课本第72页相关内容，填写下表：】
本节小结
基因工程
的工具
限制酶
①主要存在于原核生物中
②具有专一性(识别序列)
③切开DNA分子的磷酸二酯键产生黏末端或平末端
DNA连接酶
连接磷酸二酯键
种类
E.coliDNA连接酶
T4 DNA连接酶
质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
载体
具备的
条件
①能在宿主细胞中自我复制并稳定存在
②具一种至多种限制酶切点
③具标记基因
（1）粗提取DNA的原理:
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
①在酒精溶液中的溶解性：
②在NaCl溶液中的溶解性：
DNA不溶于(冷)酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（2）鉴定DNA的原理:
在一定温度（沸水浴）下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
1
实验原理：
2
材料试剂：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（1）选材：
【思考】能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？
不能
哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。
【思考】能否选用鸡血细胞做实验材料？
能
鸡是鸟类动物
（2）试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的冷酒精
③2mol/L的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶活性
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
NaCl 溶解DNA
课P74
3
实验过程：
冷酒精析出DNA
DNA的鉴定（沸水浴、二苯胺）
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
纱布过滤取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液(或离心后取上清液）。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
4
注意事项：
①以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
②利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
③加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。
④加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
⑤预冷的酒精具有以下优点：a.可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；b.抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；c.低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
课P74
思考·讨论：
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。
从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
本试验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。
　　例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿——异丙醇混合液（体积比为24:1），通过离心将蛋白质及其它杂质除去，取清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的粘稠液体。此外，由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将二者分开。
５. 进一步探究
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A. 大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
二、拓展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
二、拓展应用
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
二、拓展应用
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。

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