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(共28张PPT)
3.2基因工程的基本操作程序
第一课时
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
从社会中来
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
基因工程的基本操作程序
抗虫棉的培育过程
目的基因的 筛选与获取
基因表达载体的构建（核心）
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
1
目的基因的筛选与获取
（1）目的基因：
①概念：用于改变_______________或获得_______________等的基因。
受体细胞性状
预期表达产物
②实例：
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
主要指编码蛋白质的基因。
（2）筛选目的基因的方法：
①较为有效的方法：从相关的__________和____________的基因中进行筛选。
②实例：
已知结构
功能清晰
苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：在某类昆虫肠道的碱性环境中表现毒性，对人畜无影响
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
（2）获取目的基因的常用方法：
●利用PCR获取和扩增目的基因
概念：PCR是__________________的缩写，它是一项根据___________________的原理，在体外提供________________的各种组分与反应条件，对_________
________________进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
参与DNA复制
目的基因
①全称：
②原理：
③操作环境：
④目的：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
的核苷酸序列
PCR扩增仪
●从基因文库中获取
解旋酶
DNA聚合酶
母链(模板链)
子链(新合成的链)
四种脱氧核苷酸
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
回顾：体内DNA复制
(2)条件:
4种游离的脱氧核苷酸
DNA的两条链
DNA解旋酶、DNA聚合酶等
ATP
(3)复制原则:
碱基互补配对原则（A与T、C与G配对保证复制的准确进行）
能量：
模板：
原料：
酶：
半保留复制、边解旋边复制
(1)特点:
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
①DNA模板（需含有目的基因）。
②四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
③分别与模板DNA相结合的2种引物。
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
⑥能严格控制温度的温控设备。
dATP
PCR反应体系需要的条件
DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA有羟基（-OH）的一端称为3’端，而没有羟基的一端称为5’端。DNA的合成方向总是从5’端到3’端延伸。
注意：
5’
3’
5’
3’
在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（通常为小的单链RNA）
PCR和DNA的体内复制是否完全相同？
利用PCR获取和扩增目的基因
2.DNA体外复制（PCR）的条件：
体内DNA复制 参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中
参与的组分
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
无需解旋酶，用高温(90℃以上)代替
DNA模板(含目的基因的DNA 片段)
4种脱氧核苷酸(dNTP)
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（变性）
提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
2种引物(常为小的单链DNA，通常为20-30个核苷酸)
一.目的基因的筛选与获取——脱氧核苷三磷酸
dATP
腺嘌呤脱氧核苷酸
dADP
腺苷（A)
腺嘌呤
脱氧
核糖
P
P
P
~
~
OH
H
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
⑥引物
1、概念：
是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
2、作用：
引物能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
3、结合部位：
引物结合在模板链的_________。
3’端
拓展
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
子链延伸方向5’ 3’
PCR过程
90
50
72
℃
延伸
90
50
72
℃
变性
90
50
72
℃
复性
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。
（3）PCR扩增目的基因的过程：
课P78
第1步：变性
当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
95
50
72
℃
预变性 90 ℃以上 增加大分子模板DNA彻底变性的概率
长度相同但C-G含量高的DNA需要设定的变性温度较高。
课P78
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
5’
3’
3’
5’
第2步：复性
5’
3’
3’
5’
课P78
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
第3步：延伸
课P78
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
课P78
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
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3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
每次循环后目的基因的量可以增加一倍，即形成指数式扩增(2n)。
课P78
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
采用 来鉴定PCR的产物。
琼脂糖凝胶电泳
PCR反应过程视频讲解
比较PCR技术与体内DNA复制
项目 PCR技术 体内DNA复制
不 同 点 场所
解旋方式
酶
引物
特点
ATP
温度条件
结果
细胞外（主要在PCR仪内）
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶催化
DNA在高温下变性解旋
解旋酶、DNA聚合酶
小段RNA或单链DNA分子
一小段RNA
体外迅速扩增
生物体内边解旋边复制
不需要
需要
在较高温度下进行
细胞内温和的条件
短时间形成大量DNA片段
形成完整的DNA分子
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
01
（3）从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因文库的种类
基因组文库
部分基因文库
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
（如：cDNA文库）
互补DNA
一、目的基因的筛选与获取
3.目的基因的获取
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
(1)基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
基因表达载体
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
(2)部分基因文库（如cDNA文库）构建
提取某种生物某器官或特定发育时期的mRNA
单链互补DNA
双链DNA片段
基因表达载体
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
mRNA
逆转录酶
核酸酶H
RNA-DNA杂交双链
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
与载体连接
导入受体菌中储存
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以

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