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(共40张PPT)
1.2.1 微生物的基本培养技术
从社会中来
食用自制酸奶导致
肠胃不适屡见不鲜
发酵物混入杂菌
葡萄酒变质
【思考】那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术
一、培养基的配制
1. 培养基
人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。
营养物质
生长繁殖
2. 培养基的类型
（加入凝固剂：如_______）
呈固体状态的培养基
按物理性质分类
液体培养基：
不含凝固剂、呈液体状态的培养基
固体培养基：
琼脂
分离、计数、鉴定等
扩大培养、工业生产
微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
微生物生长繁殖产生的菌落
沙门氏菌
毛霉
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
（补充) 培养基的类型及用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类、鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
划分标准 培养基类型 配制特点 主要应用
物理状态 固体培养基 加入琼脂较多 菌种分离,鉴定,
计数
半固体培养基 加入琼脂较少 菌种保存
液体培养基 不加入琼脂 工业生产，连续培养
成分 合成培养基 由已知成分配制而成，培养基成分明确 菌种分类、鉴定
天然培养基 由天然成分配制而成，培养基成分不明确 工业生产,降低成本
用途，功能 鉴别培养基 添加某种指示剂或化学药剂 菌种的鉴别
选择培养基 添加（或缺少）某种化学成分 菌种的选择，分离
一、培养基的配制
3. 培养基的营养组成
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
1）碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
2）氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
3）无机盐：
Ca、K 、Mg为大量元素
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素
P10【旁栏思考】为什么培养基需要氮源？
一、培养基的配制
3. 培养基的营养组成
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）
（2）还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
例：培养乳酸菌要添加维生素；
培养霉菌要调酸性；
培养细菌要调至中性或弱碱性 ；
培养厌氧菌要提供无氧条件。
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
随堂练习
1. 下列四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，正确的是( )
A.硝化细菌 B.乳酸菌 C.酵母菌 D.衣藻
2. 下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）
A. 是碳源的物质不可能同时是氮源 B. 凡碳源都提供能量
C. 除水以外的无机物只提供无机盐 D. 无机氮源也能提供能量
D
硝化细菌 乳酸菌 酵母菌 衣藻
能源 氧化NH3 分解乳酸 固定N2 利用光能
碳源 CO2 糖类 糖类 CO2
氮源 NH3 N2 N2 NO3-
代谢类型 自养需氧型 异养需氧型 异养需氧型 自养需氧型
A
牛肉膏等
C×D√ NH3被某些细菌分解时可供能
×CO2
1. 获得纯净的微生物培养物的关键：________________。
二、无菌技术
防止杂菌污染
2. 消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为______的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部_________微生物 使用_____的理化方法杀死物体内外______的微生物，包括___________。　　　
常用方法 ______消毒法、巴氏消毒法、______消毒法、紫外线消毒法 ______灭菌、干热灭菌、_____灭菌
适用对象 操作空间、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
温和
芽孢和孢子
所有
强烈
一部分
湿热
煮沸
酒精
灼烧
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
【拓展】
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在_______________上并在_______________附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
3. 具体操作
二、无菌技术
酒精灯火焰
超净工作台
超净工作台
无菌技术措施的选择原则。①考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
1、消毒
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
（1）概念：
（2）消毒的方法：
①煮沸消毒法： 100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法： 62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台
资料卡：常用的消毒和灭菌方法
70%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。
2、灭菌
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）灭菌的方法：
①灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位
资料卡：常用的消毒和灭菌方法
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热1-2h
2、灭菌
资料卡：常用的消毒和灭菌方法
干热灭菌箱
2、灭菌
资料卡：常用的消毒和灭菌方法
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
对象：培养基等
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
③湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min
高压蒸汽灭菌锅
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
消毒与灭菌
接种室、接种箱，超净工作台
【P10旁栏思考题】无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
【P10相关信息】生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
【思考】用于生物消毒的微生物具有什么特点？
用于生物消毒的微生物能产生杀死其他微生物的代谢产物或是寄生性的微生物。
第一章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
第1课时 微生物的基本培养技术
授课教师：吴晓微
WxW
选必三 P11
三、微生物的纯培养
1. 概念：
三、微生物的纯培养
（1）在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
（2）由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
（3）获得纯培养物的过程就是纯培养。
配制培养基、灭菌、接种、分离、培养
2. 步骤：
选必三 P12
探究 实践：酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
获得单菌落的方法：　　　 　、　　　 　　　。
稀释涂布平板法
平板划线法
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
纯培养原理：
菌落特征：
大小、形状、颜色、光泽度、透明度等。
鉴定菌种的重要依据
选必三 P12
探究 实践：酵母菌的纯培养
(1)配置培养基：
称取去皮马铃薯200g切块，加水1000 mL，煮烂，用纱布讨滤，加20g____________，15-20 g______，用蒸馏水定容至1000 mL。
(2)灭菌：
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入__________________中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入______________内，在160-170℃灭菌2h.
1. 制备培养基
葡萄糖/蔗糖
琼脂
高压蒸汽灭菌锅
方法步骤：
干热灭菌箱
包器材
选必三 P12
探究 实践：酵母菌的纯培养
(3)倒平板：
待培养基冷却至___℃，在_________________倒平板。
1. 制备培养基
方法步骤：
50
酒精灯火焰附近
倒平板的具体操作(在超净工作台上操作)：
再置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满皿底部，待凝，使之形成平面。
棉塞须拿在手上，不可放在桌面
▲倒置
琼脂在44℃以下凝固
局部高温使微生物难以生存
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发/避免培养基中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
“制备培养基”中的问题要点：
选必三 P13
探究 实践：酵母菌的纯培养
方法步骤：
2、接种和分离酵母菌
通过_________在固体培养基表面____________的操作，将聚集的菌种逐步__________到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
接种环
稀释分散
平板划线的具体操作：
杀死接种环上的微生物，避免污染培养基
目的？
连续划线
目的？
避免因接种环温度太高而杀死菌种
选必三 P13
探究 实践：酵母菌的纯培养
2、接种和分离酵母菌
不要划破培养基（原因：①会导致划线不均匀，难以分离出单菌落；②留存在划线处的单个细胞无法形成规则的菌落，菌落会沿着划破处生长）
杀死残留菌种，保证下次划线时的菌种来自上次划线末端（，从而通过划线次数的增加，使每次划线时的菌种数目逐渐减少，最终得到单菌落）。
平板划线的具体操作：
防止最后一区分离出来的单个细胞与第一区高浓度的细胞混杂，无法得到单菌落。
选必三 P13
探究 实践：酵母菌的纯培养
2、接种和分离酵母菌
连续划线法
分区划线法
“平板划线”实验操作
划3个平板（重复实验）
1个不划线（空白对照）检测灭菌是否彻底、倒平板时是否被杂菌污染
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
分区划线法
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
及时杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下次划线的菌种来源于上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。
杀死接种环上原有微生物，避免污染
“接种和分离酵母菌”中的问题要点：
选必三 P13
探究 实践：酵母菌的纯培养
3、培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24 48 h。
结果分析与评价
1. 未接种的培养基表面是否有菌落生长，如果有，说明了什么？
未接种的培养基是不能有菌生长的，如果有菌生长，则说明受到污染或者灭菌不彻底。不仅表面不能有菌生长，内部也不能有菌生长。正确的做法是：配好培养基之后，先将培养基放在恒温箱里培养24小时观察，长菌的培养基应该丢弃，无菌生长的才能使用。这样做的另一个好处是将培养基上的水气和培养基表面的水蒸发干，不会对细菌培养产生影响。
结果分析与评价
2. 在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了菌落？这些菌落的颜色、形状、大小是否一致，如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析可能是哪些原因引起的吗？
3. 你是如何记录实验结果的？请与其他同学交流、互评。
选必三 P13
探究 实践：酵母菌的纯培养
培养基灭菌不彻底/接种过程中感染了杂菌/接种的菌种不纯。
随堂练习
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)1．液体培养基含有水，而固体培养基不含水。( )
2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 ( )
3．用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。( )
4. 倒完平板，应立即将平板倒置，等待培养基冷凝（ ）
4．将平板倒过来放置的原因是防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。( )
5．转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。( )
灭菌
冷凝后再倒置
随堂练习
1. 下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是(　　)
A．灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子
B．灭菌和消毒实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等
B
提示：灭菌与消毒的实质是不同的。灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子，使用的是较为强烈的理化因素，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等，根据不同的材料选用不同的灭菌方法，如接种环的灭菌用灼烧法；消毒是指杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，使用的是较为温和的物理或化学方法。
随堂练习
2. 下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是(　　)
A．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B．步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理
D．划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
B
倒入培养基后，
盖盖、冷凝、倒置
随堂练习
3．下表是培养某微生物的培养基的配方，请回答下列问题：
(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、_____和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是_______________。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行________处理。
(2)在配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑________、________和渗透压等条件。
(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需进行清洗和______；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质______，还能损伤DNA的结构。
组分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 1 000 mL
氮源
牛肉膏和蛋白胨
灭菌
温度
酸碱度
灭菌
消毒
变性
氧气
随堂练习
3．下表是培养某微生物的培养基的配方，请回答下列问题：
(4)分离纯化微生物最常使用的接种方法是___________和______________。
(5)在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是____________________________________________________________。
组分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 1 000 mL
平板划线法
将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生
稀释涂布平板法
随堂练习
右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 。
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
自养型微生物
含碳有机物
固氮微生物
一、概念检测
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。 （ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。 （ ）
2．日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
练习与应用 （书本P14）
腌制（盐、糖、酒等）、干制、低温……
二、拓展应用
1．某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有：_________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿、培养基
接种
用70%的酒精擦拭双手、戴消过毒的手套……
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
（2）从图中数据你可以得出什么结论？其原因是什么？
（3）为什么培养8 h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定？
二、拓展应用
2．某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210 r/min、230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
培养液中的氧含量不同。
达到了环境容纳量/K值。
在一定范围内，摇床转速
越快/培养液中O2含量越高，酵母菌种群密度越大/繁殖速度越快。

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