资源简介

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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
本节聚焦
怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？
如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？
测定微生物数量的常用方法有哪些？
二、微生物的选择培养和计数
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。PCR技术是一种常用的DNA扩增技术，此项技术的自动化，需要使用耐高温的DNA聚合酶，如果请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？热泉70-80摄氏度的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而耐热水生栖热菌脱颖而出。水生耐热细菌Taq（一）微生物的选择培养1）实验室微生物的筛选原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。1.如何筛选菌株2）选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。问：如何筛选自养型微生物，如何筛选固氮细菌，如何筛选真菌？只有无机碳源，没有氮源，加入青霉素的培养基1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+ CO22NH3+ H2O思考·讨论？讨论1．如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？碳源、氮源、水、无机盐等。该培养基以尿素作为唯一氮源，使培养基具有了选择作用，即只允许以尿素作为氮源的微生物生长。讨论2．该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？【例题3】：甲、乙、丙是三种微生物，下表I、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在I中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是（ ）
粉状硫10g K2HPO4 4g FeS04 0.5g 蔗糖10g (NH4)2SO4 4g H20 100ml MgS04 9.25g CaCl2
0.5g
I + + + + - + + +
Ⅱ + + + - + + + +
Ⅲ + + + + + + + +
A．甲、乙、丙都是异养微生物
B．甲、乙都是自养微生物、丙是异养微生物
C．甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物D．甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物
D
接种和分离方法：平板划线法和稀释涂布平板法
每克土壤究竟含有多少这样的细菌？接种和分离方法？
场所？
接种方法 优点 缺点 联系
平板划线法
稀释涂布平板法 将微生物分离得到单菌落
将微生物分离得到单菌落 ，可以计数
菌种稀释较麻烦
不能计数
目的：获得单菌落，以便分离纯化微生物
1、活菌计数法（间接计数法）——统计菌落数来推测活菌数（二）微生物的数量测定稀释涂布平板法思考1：为什么计数平板上的菌落数可以推测样品中的活菌的数目？1）计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。2、活菌计数法——统计菌落数目稀释涂布平板法2）计数原则样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。未设置重复组，结果不具有说服力。1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。重复组的结果一致（两个或两个以上）提示：若菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。思考2：统计的菌落数往往比活菌的实际数目高还是低，为什么？3)结果偏低。原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。2、活菌计数法——统计菌落数目稀释涂布平板法【解析】选B。稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。每mL样品中的菌株数=（C÷V）×MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积M：稀释倍数【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）A.2.34×108　　B.2.34×109C.2340　D.23.42、活菌计数法——统计菌落数目稀释涂布平板法思考3：如何根据平板上的菌落数推测出每mL样品中的菌株数？1mm（二）微生物的数量测定2、直接计数法（显微镜计数法）①不能区分死菌与活菌；②不适于对运动细菌的计数；③个体小的细菌在显微镜下难以观察缺点结果偏高血细胞计数板(1)工具：特定的细菌计数板（小）或血细胞计数板（大）。(2)统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。1.提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。
2.做出假设
3.实验设计
实验步骤
探究·实践 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
实验原理
只有能合成____的微生物才能分解尿素，利用以_____作为唯一氮源的___________，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
脲酶
尿素
选择培养基
用稀释涂布平板法接种和分离土壤微生物
微生物的
培养与观察
制备
培养基
土壤
取样
①土壤取样
A 取样地：酸碱度接近中性的肥沃、潮湿土壤中。
B 取样：铲去表层土（一般3cm左右）。
细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
4.进行实验
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意
探究·实践 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
②制备培养基
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
4.进行实验
探究·实践 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1）从物理性质看此培养基属于哪类？
2）在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
碳源是葡萄糖和尿素，氮源是尿素
讨论1：怎样证明是否有杂菌污染？
空白对照：未接种培养基上是否有菌落
怎样证明此培养基具有选择性？
对照组
实验组
培养基类型
是否接种
结果
以尿素为唯一氮源的选择培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基
是
是
生长较多菌落
生长较少菌落
制备牛肉膏蛋白胨培养基
完全培养基/普通培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）上菌落数是否明显多于选择培养基上的
条件对照：
4.进行实验
③样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选择一个比较宽的范围（预实验），将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
探究·实践 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
(1)每个浓度设置了 个平板，
3个平板是选择培养基（ 实验），
1个平板为 培养基（条件对照：验证选择培养基是否具有选择作用）；
(2)另外，整个实验还要设置 个空白
对照平板：未接种的_____________
_____________培养基，以验证培养基
中是否有杂菌污染。
4
重复
牛肉膏蛋白胨
2
选择培养基和
牛肉膏蛋白胨
③样品的稀释与涂布平板
4.进行实验
探究·实践 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。
结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
4.进行实验
③注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等；
④微生物的培养与观察
24h
菌落数目稳定
因培养时间不足而导致菌落数目遗漏
探究·实践 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
6．菌落计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目（如下表）。
7．结果分析与评价
稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
每个平板的菌落数
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 空白对照的培养基中无菌落生长 未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高 被杂菌污染，培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数在30~300的平板 操作成功
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
5.进一步探究
方法：在培养基中加入酚红指示剂
——鉴别培养基
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
探究·实践 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
练习
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
提示：可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
P20 【练习与应用】
鉴别培养基
选择培养基
10.图甲是稀释涂布平板法中的部分操作,图乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中错误的是 (　　)
甲
A.图甲中,涂布前要将涂布器灼烧,冷却后才能涂布菌液
B.对于浓度较高的菌液,如果稀释倍数仅为1×102,那么,所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C.图乙的培养皿中所得的菌落都是目的菌落,无须进行进一步的鉴定筛选
D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端
乙
C
【金版学案】P28
稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107
平均菌落数 >500 367 248 26 18
9.土壤是微生物的天然培养基,下面是有关土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的实验过程,请根据右上图回答相关问题。
(1)为分离出土壤中分解尿素的细菌,应该用　　　　　　　　　　的选择培养基进行分离,并加入　　　　　指示剂进行鉴别。
(2)若取土样5 g,应加入　　　　　　　中配制成1×101倍稀释的土壤溶液。因土壤中细菌密度很大,需要不断加以稀释,配制成如图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前,一定要　　 　以减少误差。从1×103~1×107倍稀释的稀释液中分别吸取0.1 mL加到固体培养基上,用　　 　　　　　将其分散,每个浓度稀释液至少接种　　　个平板,以减少实验误差。
(3)将接种的培养皿　　　在30~37 ℃的　　　　　箱中培养1~2 d,观察并统计　　　　　　,结果如下表所示。找出合适浓度,推测出每克土样中的菌落数为　　　　　。
以尿素为唯一氮源
酚红
45 mL无菌水
摇匀(振荡、混匀)　
涂布器
3
倒置
恒温培养
菌落数
4.96×107
【金版学案】P34
练习
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
二、拓展应用
P20 【练习与应用】

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