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3.1 细胞培养是动物细胞工程的基础
动物细胞工程常用的技术手段：
动物细胞培养、 动物细胞核移植、动物细胞融合
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
动物体细胞可在体外适宜条件下进行培养
一、动物细胞培养
概念 从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
原理：
细胞增殖（有丝分裂）
地位：
动物细胞工程的基础
1、适宜的温度、湿度、pH、气体条件
①设备：二氧化碳培养箱
②温度：37℃±0.5℃
③PH：7.2~7.4
④气体条件：5%的CO2+95%的空气
思考1：在体外动物细胞培养中5%CO2和95%的空气分别有什么作用？
5%CO2调节PH的相对稳定
95%的空气可以保证细胞呼吸对氧气的需要
二、动物细胞培养的条件
任务一：根据教材64-65页，总结动物细胞培养的条件
2、无菌、无毒的条件
①培养材料、培养基、培养环境、操作过程严格控制无菌
②在培养基中加入抗生素
③血清等成分采用过滤除菌
④定期更换培养液，
思考2：如何控制？
，抑制细菌和真菌的生长
以防止细胞代谢产生的有毒物质危害细胞
3、营养
动物细胞培养中营养物质通常有液体培养基提供
实际工作中往往在合成培养基中添加一定比例的血清或其他天然成分。
思考3：为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？
由于人们并没有完全了解动物细胞所需要的全部物质，而血清含有丰富的营养物质及各种生长因子等，所以往往在合成培养基中添加血清。
动物细胞培养包括原代培养和传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
细胞贴壁
接触抑制
任务二：据图，总结动物细胞培养的一般过程
1.取动物组织
（1）取材:
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
（2）取材原因:
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
2.制成细胞悬液
（1）将组织分散成单个细胞
①方法:
用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
②原因:
Ⅰ.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；
Ⅱ.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。
思考4：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2,当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
思考5：在用胰蛋白酶酶解组织块时，由于胰蛋白酶比较温和，一定不会对细胞造成损伤吗？
使用胰蛋白酶消化处理组织块时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，会对细胞造成损伤。
3.原代培养
（1）操作方法：
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
（2）体外培养的动物细胞类型
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
②贴壁生长类：
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁）
大多数细胞属于此类。
如来源于血液、淋巴组织的细胞以及某些肿瘤细胞
细胞或组织离开机体后的首次培养。
(3)动物细胞的生长特性
悬浮液中分散的细胞贴附在培养瓶内壁才能生长。
①贴壁生长：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
除受密度、有害代谢物、营养物质影响外，还会发生接触抑制现象。
②接触抑制：
平面观
单层细胞
接触抑制是体外细胞培养时贴附型细胞生长的特性。
癌细胞无接触抑制，会继续移动和增殖发生堆积。而正常细胞有接触抑制……
思考7：细胞发生接触抑制后如何使细胞继续分裂增殖？
思考6：为什么 是否接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一？
细胞发生接触抑制，细胞分裂停止，所以一般来说，原代培养的贴壁细胞达到生长基质的80%表面面积后可进行传代培养，并且细胞培养一段时间后由于培养空间限制、营养物质枯竭细胞分裂也会停止。
4.分瓶、进行传代培养
（1）需分瓶进行传代培养的原因：
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质的消耗枯竭等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
（2）方法：
①收集细胞
a.悬浮生长类：
直接用离心法收集
b.贴壁生长类：
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
什么是细胞系？
细胞系
原代培养物（是细胞系）
细胞系：
泛指可传代的细胞群，原代培养物及其经传代培养后所得到的的细胞群。
①连续细胞系（或无限细胞系）
②有限细胞系：
能连续培养下去的细胞系，无限传代，具不死性，
不能连续培养下去
遗传物质改变（发生转化），具有异倍体核型
包括恶性细胞系：具有异体致瘤性，失去接触抑制；
非恶性细胞系：无异体致瘤性，保留接触抑制。
二倍体细胞（2N）
从细胞接种到分离再培养的一段时间。
≠细胞周期，细胞培养一代相当细胞周期3～6次。
显微计数法
思考9：随着传代次数不断增加，传代间隔时长如何？ 为什么？
随着传代次数不断增加，细胞逐渐衰老，分裂速度变慢，传代间隔时长 越来越长
思考8：细胞培养过程中的“一代”指的是什么？是细胞周期吗？
如人的成纤维细胞可传30～50代，相当于150～300个细胞周期。
什么是细胞株？
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞系。
1.概念：
3.获得方式:
细胞系筛选法
细胞克隆或克隆培养法
（1）起点：
（2）过程
（3）产物：
具有恒定的染色体组型、病毒敏感性或抗性及其他生化特性等。
2.特点：
包括连续细胞株和有限细胞株
保证分离出来的细胞是一个
遗传性状均一、基因型一致的纯系
未经克隆的异质性细胞系
纯系：
克隆
经克隆以后的细胞的后裔细胞群，来源于一个共同的祖细胞。
细胞克隆
动物组织切片中取小片样品
转入特殊培养液
原代培养
单个细胞悬浮液
胰蛋白酶消化
原代培养物
选择或纯化
选择或纯化
分装到多个卡氏瓶中
传代培养
细胞系
细胞株
细胞株
动物细胞培养过程
比较细胞系和细胞株
种类 来源 特点 细胞系 有限细胞系 由二倍体细胞传代培养建成 有接触抑制；不能连续培养 连续细胞系 由传代细胞连续培养建成 发生了转化，多数具有异倍体核型；有些具有异体致瘤性；有些具有不死性，但不致癌 细胞株 有限细胞株 通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞 传代次数有限 一般具有恒定染色体组型、同功酶类型、病毒敏感和生化特性等
连续细胞株 可连续 多次传代 5、动物细胞培养技术的应用
任务三：阅读教材P68最后一段，归纳动物细胞培养技术的应用。
（1）研究价值
细胞全能性的揭示
细胞周期调节控制的分析
癌变机理和衰老原因
抗癌药物的筛选
有毒物质的检测
培养正常或病变的细胞，可用于生理、病理、药理等方面的研究
运用细胞培养技术的相关研究
（2）应用价值
①皮肤细胞的培养用于烧伤患者的皮肤移植，其他器官的细胞培养用于相关损伤组织器官的修复
②借助于某些细胞的大规模培养获得细胞代谢产物
动物疫苗
干扰素
单克隆抗体
动物细胞培养
条件
过程
应用价值
原代培养
分散成
单个细胞
胰蛋白酶
问题
细胞分裂停止
培养空间限制、营养物质枯竭
贴壁生长
接触抑制
解决
传代培养
酶解、分瓶
动物
组织
适宜的温度、湿度、PH、气体条件
无菌、无毒的条件
营养条件
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的物理性质
培养基的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分
无机营养成分
植物激素
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清
植物激素
血清
动物细胞培养和植物组织培养的比较
植物组织培养动物细胞培养特殊环境条件结果是否体现细胞的全能性过程相同点再分化需光气体环境一般获得新的植株获得大量细胞是否①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。动物细胞培养和植物组织培养的比较外植体脱分化愈伤组织再分化根、芽幼苗完整植株移栽成活取动物组织制成细胞悬液转入培养液进行原代培养分瓶进行传代培养A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行
B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离
C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理
D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化
（2021·1月浙江选考）下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是（　）
C
(1)过程②表示_______________。
(2)过程③和⑥表示用______________处理组织或处理贴壁细
胞，使之分散成单个细胞。
(3)④和⑥的过程都要把分散的细胞制成______________。
(4)过程⑤进行的细胞培养是________________，细胞适于
_________生长增殖。
(5)过程⑦进行的细胞培养是_____________，培养多代后，部
分细胞的_____________会发生改变。继续培养时，少部分细
胞发生了_________，朝着等同于癌细胞的方向发展。
剪碎组织
胰蛋白酶
细胞悬液
原代培养
贴附
传代培养
遗传物质
突变
完成下列动物细胞培养的有关内容

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