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第二节 通过细胞核移植克隆动物
第二章 动物细胞工程
细胞核移植的发展
体细胞核移植技术的应用前景及存在问题
细胞核移植的过程
目 录
“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声‘变！’，即变作三二百个小猴，周围攒簇。”这是《西游记》中的一段描述，展示了中华先贤的想象力。毫毛来自体细胞，我们能用体细胞“变”出猴来吗？　　　　　
2017年，我国科学家通过动物细胞核移植技术首次培育了体细胞克隆猴。
资料1：1938年，斯佩曼提出将胚胎细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中构建新胚胎的设想。
资料2： 1952年，布里格斯和金将豹蛙囊胚细胞的核移植到去核的卵中，形成重组细胞，重组细胞发育成蝌蚪，胚胎细胞核具有发育的全能性。
资料3： 1962年，我国的童第周首次将核移植的技术应用于鱼类.
以上实验均证明早期胚胎细胞的细胞核具有发育的全能性
任务一：根据以下资料，总结能够得出的结论
一、将植物体细胞核移入一个去核卵细胞后形成的重组细胞可发育成动物个体
概念：是指将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中，并使其发育成动物个体的过程。利用该技术培育出的动物称为克隆动物。
动物细胞核移植
通常选减数第二次分裂中期
思考1:在供体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？
为使核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自供体细胞。
思考2:动物细胞实际上表现出全能性的情况如何呢？
全能细胞：可发育成完整个体，例如：受精卵及其第一次
卵裂所得的2个分裂球（子细胞），每个细胞可发育成完整个体，形成同卵孪生个体
多能细胞：只具有分化出多种组织细胞的潜能，例如：
多能造血干细胞（可分化为红、白细胞、血小板），小鼠囊胚期原始 外胚层细胞也是多能细胞，可分化为生殖细胞等多种细胞、组织。
单能细胞：有的只能分化为一种细胞，例如：单能造血干细胞
无分化能力的细胞：已经分化，不再分化为其他细胞，如高度分化的神经细胞。
随着胚胎发育的继续，细胞在形态和功能上高度特化，不再具有发育成为完整个体的能力
动物发育过程中， 随着动物细胞分化程度的提高，全能性逐渐降低。
（细胞核基因组仍然完整，理论上具有发育的全能性。）
动物细胞的细胞分化使得细胞发生了基因的差异表达，有的开放，有的关闭。基因组中基因的活动很不完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性。
思考3：你认为，动物难以克隆的根本原因是什么？
资料4:1958年，英国牛津大学 戈登 蛙的肠上皮细胞核移植
动物成熟体细胞的细胞核仍然具有脱分化和使其后代细胞再分化实现全能性的能力
资料5:1978年，童第周将黑斑蛙成体红细胞的细胞核移植到去核未受精的卵中，使重组细胞发育成了正常的蝌蚪。
思考4：理论上，分化的动物细胞能像植物细胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？
蛙肠上皮细胞和胚胎细胞核移植
二、通过细胞核移植克隆出的动物与核供体具有相同遗传物质
资料6：我国科学家童第周发现，在核移植实验中，肠上皮细胞核移植只有1%~2%的重组细胞形成蝌蚪，而囊胚细胞核移植时50%的重组细胞形成蝌蚪或可育成蛙
胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞
（后者分化程度高，细胞的全能性逐渐降低）
去核常用方法：
1.低等两栖动物：紫外线破坏处理
2.高等哺乳动物：显微去核针吸出 （显微操作法）
由此，你可以得出什么结论？
低等动物细胞的全能性一般比高等动物容易体现。
如：水螅的消化细胞不经过细胞分裂即可转变为上皮细胞、肌肉细胞。
思考5：不同的动物细胞，全能性的表现程度相同吗？
①卵细胞体积小
②要借助精密的显微操作仪和高效率的细胞融合法
③胚胎需要在体内发育（胚胎移植）。
思考6：哺乳动物细胞核移植实验存在哪些难度？
哺乳动物细胞核移植实验：
小鼠核移植实验的基本过程：（囊胚细胞的细胞核移植）（71）
第一步：是将小鼠囊胚细胞的细胞核,移入到一个已经去掉细胞核的受精卵中，形成重组细胞（核移植）；将重组细胞体外培养，发育成早期胚胎（囊胚）（胚胎体外培养）。
第二步：将早期胚胎移植到同步孕（同期发情）的鼠（同种动物）的子宫中（胚胎移植），使其最终发育为动物个体。该个体叫克隆动物，该过程叫动物的克隆繁殖。
不过，以哺乳动物成熟的体细胞为核供体的体细胞克隆直到“多莉”的问世才算成功。
（3）绵羊“多莉”克隆过程：
克隆动物的母本有三个，即体细胞核供体、卵细胞细胞质供体和代孕母体。
(1)克隆动物细胞核基因来自于体细胞核供体，因此，克隆动物的性状与体细胞核供体基本相同（包括性别）。
(2)克隆动物的细胞质基因来自于卵细胞，因此，克隆动物的性状与卵细胞供体部分相同。
(3)代孕母体没有为克隆动物提供遗传物质，因此，克隆动物的性状与代孕母体没有直接关系。
思考7：绵羊“多莉”的母亲有几个？长得像谁？
1、证明了高度分化的细胞经过一定技术处理，也可以回复到类似受精卵时期的功能，表现出全能性；（高度分化的细胞，其细胞核具有全能性）
2、证明了在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用
思考7：羊体细胞克隆成功能够证明什么？
1、重组卵细胞最初分裂时，虽然复制了DNA，但基因的转录并未开始。
2、供体核DNA（乳腺细胞的核DNA）开始丢失了源于乳腺细胞的调节蛋白，正是这些调节蛋白最初阻止了核基因的表达。
3、经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞的细胞质中的蛋白因子替换了，因此核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因，进而调控胚在代孕母亲子宫中的进一步发育。
思考8：克隆羊成功的分子细胞生物学机理是什么
卵细胞的细胞质调控重组细胞的核基因表达
（1）具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞。(如乳腺上皮细胞)
（2）能有效调控细胞核发育的细胞质物质。
（如去核的卵的细胞质）
（3）完成胚胎发育的必要的环境条件。
（如诱导核-质重组细胞生长、
分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）
思考9:克隆成功的条件有哪些？（必备的基础）
去核卵细胞
体细胞核
细胞核移植
重组细胞
电脉冲刺激
早期胚胎(或重组胚胎）
胚胎移植
母体子宫（同步孕）
妊娠、出生
个体
卵裂3次
动物细胞培养
请归纳动物的克隆繁殖过程
动物细胞培养技术、体细胞核移植技术、动物细胞融合技术、早期胚胎培养技术、胚胎移植技术等。其中核心技术是体细胞核移植技术。
思考10：克隆动物涉及哪些生物技术：
1.细胞核移植的原理
2.供体和受体的选择
关于动物克隆的几个问题：
(2)受体：卵细胞或受精卵。其原因是：
动物体细胞核移植的原理是细胞核的全能性，而不是动物细胞的全能性。
(1)供体：提供细胞核的细胞，一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。
①卵细胞的细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。(体细胞质有抑制细胞核全能性表达的物质)
②卵细胞体积大，便于操作，卵细胞内卵黄多，营养物质丰富。
a.营养限制性培养 :
将这些乳腺细胞先保持在含有10%牛血清的培养基中，在与卵细胞融合前，将牛血清的浓度降到0.5%，这种牛血清饥饿处理使乳腺细胞处于细胞周期的G0阶段。由于培养过程中通过降低血清浓度限制了细胞增殖所必需的某些营养，称为营养限制性培养。
营养限制性培养的目的是通过减少细胞中基因的表达利于供体细胞核的一系列变化和细胞融合后基因表达的分子开关的启动，提高克隆的成功率。
G0阶段是细胞停止分裂但仍保持代谢活性的休眠阶段，此时，细胞核内会发生一系列化学变化，导致其中基因启动程序重新编排，有利于细胞融合后卵细胞质中的蛋白因子能够再次启动乳腺细胞核的分子开关，进而对胚的发育进行调控。
首先用高分子化学材料——聚羟基乙酸制成所需人体器官的形状，然后植入人的细胞（这只展出的老鼠身上植入的是它自己的细胞），缝合在裸鼠背上。经过细胞快速生长，人造模子会自己降解消失，器官与老鼠成为一体，最后可移植到人体上。这种全身无毛的老鼠叫裸鼠，没有免疫力，这样才不会对那只“人耳”产生排异反应。这项技术能应用于人体组织、器官的再造。这项科研技术成熟后，人身上缺少或损坏的组织器官都可以修补上。
一只在背上长出了“人耳”的活老鼠。
1.应用前景
器官移植
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在问题
（1）畜牧业领域：高产奶牛
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在问题
1.应用前景
（2）繁殖优良、濒危动物
种间克隆白肢野牛
伊利挤奶站的奶牛
克隆动物作为生物反应器，生产大量医用蛋白
克隆动物（也经过转基因操作）的细胞、组织、器官可作为异种移植的供体
乳汁中分泌人抗胰蛋白酶的转基因羊
（3）医药卫生领域：---与基因工程的综合应用
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在问题
2.存在问题
该技术的成功率仍然非常低，各个技术环节也有待进一步 改进。
(2) 核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合。
(3)绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。
(1)原理：动物细胞核的全能性。
(2)供体：有重要利用价值的动物的体细胞。
(3)受体：MⅡ期卵母细胞
①选择原因：a.体积大，易操作；b.MⅡ期卵母细胞的细胞质中含有激发细胞核全能性表达的物质和营养条件。
②去核原因：保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞。
③去核方法：常用显微操作去核；也可采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法去核或使其中的DNA变性。
(4)克隆动物遗传物质来源
①核内遗传物质：全部来自供体细胞。
②细胞质中的遗传物质：一部分来自核供体细胞，另一部分来自受体卵母细胞。
动物体细胞核移植
核心归纳
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
诱导多能干细胞的应用：
可治疗镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
动物细胞培养（细胞群）
动物细胞核移植（动物个体）

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