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第六节 组培快繁和苗木脱毒 一、组培快繁
组织培养： 在无菌条件下，将离体植
物器官、组织、细胞或原生质体在人工培养 基中培养成完整植株的过程。
微体繁殖： 利用组织培养技术进行果
树繁殖的方法。
微体繁殖特点
占地面积小；
育苗周期短；
适宜繁殖时间长；
繁殖系数大；
可部分或全部脱除病；
技术含量高、需要大量的前期储备工作。
微体繁殖的程序
无菌培养系的建立（外植体的引入）
继代增殖培养
生根培养
组培苗驯化和移栽
1.无菌培养系的建立
（外植体的引入）
（1）培养基制备。
（2）外植体引入（接种）
外植体:用于组培的材料称为外植体。
茎尖培养:以茎尖分生组织为外植体
茎段培养:成树枝段为外植体
叶片培养:叶片为外植体
如：苹果M9外植体建立 75%酒精消毒30min结合0.1%升
汞消毒8 min
外植体取样时间、大小，无菌状态是关键！
2．继代增殖培养（扩繁）
如： MS+6-BA0.6 mg/L+IBA 0.5 mg/L+琼脂7g+蔗糖30g+NAOH
3．生根培养
如： 1/2MS+IBA1.2 mg/L
4．组培苗驯化和移栽
（1）驯化
培养壮苗；
强光闭瓶锻炼；
开瓶锻炼；
（2) 过渡移栽，
（3）大田移栽。
苹果组培快繁技术体系
SH6 、T337、G.X等苹果矮化砧木组培苗。
二、无病毒苗繁育
（一）果树病毒的种类
侵染果树的病毒和类菌原体种类很多，根据感染后的
表现和特点一般将病毒分为两类。
1.潜隐性病毒
在砧木和接穗都抗病时，感病植株无明显外观症状，
表现为慢性危害，使树势衰退，果实产量、质量、耐贮性 降低，肥水利用率下降,氮肥利用率降低40-60%，减产20- 60%。如苹果褪绿叶斑病毒、茎痘病毒、茎沟病毒。
2.非潜隐性病毒
在感病植株上有明显外观症状，一般容易识别（刨除）。
如苹果锈果病毒、花叶病毒、绿皱果病毒。
据调查，我国苹果产区病毒病危害普遍，不同品种带毒
率30-95%，给生产造成巨大损失。
迄今为止对病毒病无理想的治疗方法和有效药剂。果树
一经感染，就终生带毒。只能通过培育无病毒苗和控制病毒 传播两条途径来减少病毒的危害和扩散。因此，无病毒苗木 的培育具有重要意义
> 田间随机调查1000株花叶病毒，平均株发病率为1.35%
田间调查苹果花叶病毒感染情况
杨陵
洛川
铜川
扶风
乾县
白水
> 品种：
烟富6号、礼泉
短富、爱家的香 、A6
> 矮化砧木
T337、B9、M26
、MAC9
> 成品苗：
礼泉短富590株 烟富6号231株 A6有105株
> 组培砧木苗
脱毒苗经生根、驯化、移栽网室
调查结果
①苹果花叶病发生普遍：总发病率为30.04％。 各园发病率为8～71.1％，病情指数为50～100% , 个别新建果园的发病率已高达70%。
②苗圃中病毒病发病率高：调查的一个苗圃中苹果花叶病发生率高达55.8％，所检测的苗木中潜 隐病毒携带率为100% 。苗木带毒对苹果产业发展的潜在危害更大
③三种潜隐病毒发生普遍且复合侵染率高：100%被测样品均带有至少一种潜隐病毒，复合侵染
率高达60～80%，据此结果及田间调查数据推测所调查的果园中潜隐病毒的带毒率在60~ 80% ，约40%植株带有检疫对象苹果茎沟病毒。
推广无病毒苹果苗木刻不容缓！
（二）无病毒苗木繁育体系
无病毒苗指经过脱毒处理和病毒检测证明
不带指定病毒的苗木。严格讲为脱毒苗
无病毒原种的来源：
（1）国内外引进--检测—原种—保存
（2）选择优良母株— 脱毒— 检测— 原种—
保存。
1．无病毒原种的培育和保存
(1) 脱毒：
常用方法有：
热处理
微茎尖培养
热处理与茎尖培养结合
茎尖嫁接
珠心胚实生苗利用（柑橘）
热处理
38℃的高温不仅能延缓病毒的扩散，而且使
器官和组织的生长速度超过病毒的繁殖速度，对 病毒有钝化作用。
在37-38℃高温，60-80%湿度，处理4-9周，
取顶端长出的10-20cm作接穗（旺盛的生长点不带 毒），嫁接后—检测—原种。
l
微茎尖培养
病毒感染后，在植株内分布不均匀，生长点附近的
分生组织（0.1-0.2mm）不含病毒。进行微茎尖培养可获 得无毒原种。
热处理与茎尖培养结合
茎尖嫁接
珠心胚实生苗利用
柑桔、芒果等有多胚现象，其中有性胚中途退化，
由珠心细胞发育成珠心胚（无性胚），与体细胞有相同的 遗传性状。
光照： 10000 lx 温度： 42℃ 剥茎尖准备工作
光照： 10000 lx
温度： 34℃
显微镜下剥取0.2-0.5mm茎尖
热处理：
组培苗在42/34℃变温热处理
35d以上
剥取茎尖：
剥取 0.2-0.5 mm（关键环节）
茎尖再生：
分化培养基上培养再生植株
热处理与茎尖培养结合
湿度： 60% RH
时间： 8 h
湿度： 60% RH
时间： 16 h
> 苹果茎沟病毒（ASGV）在顶端分生组织 区域和幼嫩叶原基中都有分布，可能是 ASGV的难脱除原因之一
> 在脱毒外植体的选择上必须首先排除
ASGV
A ，ASPV叶柄横切
B ，ASGV叶柄横切
C ，D ，ASPV茎尖纵
切
E ，ASPV茎尖横切
F ，ASGV茎尖纵切
G ，ASGV茎尖横切
苹果茎沟病毒（ASGV）感染率最高，侵入生长点、侵染速度快
苹果茎痘病毒（ASPV）和苹果茎沟病毒（ASGV） 在‘M26’叶柄和茎尖中的免疫组织化学法定位
（2）病毒检测：
指示植物：田间检测；温室检测。接种方法：汁
液摩擦；嫁接；昆虫传播。
实验室检测：酶联免疫吸附法；双链RNA分析法；
聚合酶链式反应；电镜法。
（3） 原种保存
田间：隔离50-100m 。
组织培养：不断继代培养。
5-10年进行一次检测。
苹果茎沟病毒（ASGV）琼脂糖凝胶电泳图
优质无毒大苗培育技术
> ①热处理和茎尖培养相结合的脱毒方法
在变温条件下42℃16 h光照/34℃8 h
黑暗下热处理，脱除病毒
1 2
3 4
经热处理后，切取 生长点， 进行扩繁
RT-PCR病毒检测
长富2号ACLSV 、 ASGV 、ASPV 3种 病毒脱毒率为
66.7%
脱毒效果
> ②外植体建立
初代培养
继代培养
取材
生根培养、炼苗、移栽
生根培养 炼苗 移栽
（三）繁殖圃建立（三圃二制）
1．原种保存圃
2．母本繁殖圃 包括采穗圃、压条 圃、 采种圃。
3． 果苗繁殖圃
4． 检测制
5． 档案制
日光温室长富2号无病毒
苹果品种、砧木无毒采穗圃
M系压条繁育技术
苹果砧木压条繁育圃
谢谢大家！

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