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第一章
发酵工程
1.2.2 微生物的选择培养和计数
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。
这是因为水生栖热菌能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
讨论
1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
2.以上例子给我们在分离纯化微生物带来什么启示？
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
一、选择培养基
1.在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物
2.在冰川冻土层可以筛选 微生物
3.漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是
生活污水吗？
分解石油
耐寒
不是
现学现用
选择培养基的概念
在微生物学中，将允许 生长，
同时 或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
特定种类的微生物
抑制
阻止
一、选择培养基
选择培养基的类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温
添加某种化学物质 加入青霉素
高浓度食盐
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源
营养缺陷 不加碳源
不加氮源
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自养型微生物
固氮菌
一、选择培养基
怎样选择出抗氨苄（biàn）青霉素能力的细菌
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基+氨苄青霉素
培养基
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
一、选择培养基
思考
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
基础培养基
选择培养基
一、选择培养基
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
思考·讨论
？
一、选择培养基
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
2.从用途上来讲，培养基二属于 培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有： 。
培养基一的碳源为 ，氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是__________________，
。该类培养基的主要用途为 。
固体
且比例为1.5%~2%
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
一、选择培养基
1.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入
A.较多的氮源物质
B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物
D.高浓度食盐
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是
A.CO2和N2
B.葡萄糖和N2　　
C.CO2和尿素
D.葡萄糖和尿素
C
D
练习
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法——将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
注意：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
稀释涂布平板法
系列梯度稀释
涂布平板
二、微生物的选择培养
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
①铲取土样，将样品装入纸袋中
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌
注意：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。
二、微生物的选择培养
1.样品的稀释：
2.涂布平板操作：
①取0.1mL 菌液滴加到培养基表面
1×107
移液枪
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
二、微生物的选择培养
3.培养并观察培养基菌落：
待涂布的菌液被 后，将平板 ，放入30-37℃
中培养 d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。
培养基吸收
倒置
恒温培养箱
1~2
合适浓度
单菌落
恒温培养箱
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。
二、微生物的选择培养
1个不接种平板（空白对照组）
三组，每组3个涂布平板（重复实验）
未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？
未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生
长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
二、微生物的选择培养
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
二、微生物的选择培养
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
二、微生物的选择培养
3、利用稀释涂布平板法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因是
A.培养基制备过程中被杂菌污染
B.接种过程中，无菌操作不符合要求
C.系列稀释时，无菌操作不符合要求
D.使用涂布器时涂布不均匀
D
练习
要求:
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证
获得菌落数为30-300、适于计数的平板。
②同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值；
缺点: 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数表示。
①分离微生物
②统计样品中活菌的数目
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
【原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。】
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
三、微生物的数量测定
1：稀释涂布平板法（间接）
使用范围
可以用来测定土壤、水、食品等样品中的细菌、酵母菌、芽孢和孢子等的数量，但不适于测定样品中的放线菌、丝状真菌等丝状体微生物的数量。
三、微生物的数量测定
1：稀释涂布平板法（间接）
①原理：
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
②缺点：
a.不能区分死菌和活菌→偏大。
b.不适于对运动细菌的计数。
c.需要相对高的细菌浓度。
d.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
③优点：
快速、直观
三、微生物的数量测定
2：显微镜直接计数法（直接）
计数池
计数室
1mm
0.1mm
每块计数板由H形凹槽分为两个同样的计数池。
每个计数池分为9个大方格，其中间的一大方格又称为计数室，微生物的计数就在此大方格中进行。
每个计数室面积1mm2，液体高度0.1mm，所含液体体积为0.1mm3。
(1)血细胞计数板
三、微生物的数量测定
2：显微镜直接计数法（直接）
对样方的计数原则是：
如何统计结果？
思考：
方格内+相邻两边及顶角（取多个方格求平均值）
三、微生物的数量测定
2：显微镜直接计数法（直接）
16个中方格
25个中方格
16个小方格
25个小方格
酵母菌细胞个数/mL=
每个中方格平均细胞数×16
10-4
×稀释倍数
25
酵母菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
10-4
×稀释倍数
三、微生物的数量测定
2：显微镜直接计数法（直接）
它们的区别就是计数室的高度不同，细菌计数板计数室的高度是0.02 mm。
故细菌计数板计数细菌的计算是：
细菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
2×10-5
×稀释倍数
0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL
血细胞计数板和细菌计数板
三、微生物的数量测定
2：显微镜直接计数法（直接）
1.实验目的
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，
但是只有能合成脲酶的微生物才能分解
尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择
培养基，可以从土壤中分离出分离尿素
的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O
定容至1000mL
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验过程
（1）土壤取样
①取样地点要求：
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在
距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在
使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源。
组分 含量
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
提供无机盐；
调节pH。
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（3）样品稀释与取样涂布
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
思考
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
组别 具体组别 具体操作 作用
实验组 实验组1 涂布接种的选择培养基 三次重复排除偶然因素对实验结果的影响，用以分离并计数能分解尿素的细菌。
实验组2 涂布接种的选择培养基
实验组3 涂布接种的选择培养基
实验组4 涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基 实验组4与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。
对照组 对照组1 不涂布接种的选择培养基 对照组1与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。
对照组2 不涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基 对照组2与实验组4 对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。
实验结果 实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落； 第4组得到多种菌落； 对照组正常情况下无菌落。
注意：本实验实验组和对照组设计如下：
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（3）样品稀释与取样涂布
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
细 菌：30～37℃培养1～2d
放线菌：25～28℃培养5～7d
霉 菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
③计算公式:
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
例题.某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)
A.2.34×108 B.2.34×109 C.234 D.23.4
B
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
（4）微生物的培养与观察
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2、你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
3、你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
（5）结果分析与评价
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4、得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
5、进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
需要用“鉴别培养基”
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。
红
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
探究·实践
？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽)
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
拓展延伸
比较选择培养基与鉴别培养基
练习
4、下图是研究人员从红棕壤
中筛选高效分解尿素细菌的
示意图,有关叙述错误的是
A.在配制步骤②、③的培养基时,应先调pH值后高压蒸汽灭菌
B.步骤③纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落
C.步骤③采用涂布平板法接种,并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种,比较细菌分解尿素的能力
C
5、如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。请据图分析，下列说法错误的是
A
A.③号试管的稀释倍数为103
B.④号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能为⑤号试管的10倍
C.⑤号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109
D.将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后，再进行涂布
练习
7、某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是
A.可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L
B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C.一般选择菌落数为30～300的平板进行计数
D.显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数
D
6、下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是
A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h
D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
D
练习
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
概念检测
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是
A.菌落中的细菌数目是固定的
B.平板上的一个菌落就是一个细菌
C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
拓展应用
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
可以参考本节“探究·实践”中的设
计思路进行设计。
拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
谢谢观看！

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