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第二章
细胞工程
2.2.3 动物体细胞核移植技术和克隆动物
“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声‘变！’，即变作三二百个小猴，周围攒簇（cù）。”这是《西游记》中的一段描述，展示了中华先贤的想象力。
视频
西游记片段
一、动物细胞核移植技术
2017年，中国的科学家将这一幕变成了现实，他们利用体细胞核移植技术成功克隆出两只猕猴“中中”和“华华”（如下图)。克隆猴的过程当然不会像孙悟空吹口气那么简单，最大的困难是如何才能激发动物细胞表达其全能性。
毫毛来自体细胞，我们能用体细胞“变”出猴来吗？
一、动物细胞核移植技术
思考
1、为什么要进行克隆猴的研究？
研发新药时，进行药物的筛选。
2、用克隆鼠、兔等不能进行药物筛选吗？
鼠和兔等哺乳动物与人类的亲缘关系比较远，用它们筛选出来的药物对人类的效果不好甚至没有作用。
3、用自然界的猴进行药物筛选不可以吗？为什么一定要克隆猴进行药物筛选？
①自然界的猴繁殖慢，
②自然界的猴基因型不同，会干扰实验结果。
③有时用转基因猴进行药物筛选效果更好
一、动物细胞核移植技术
1.概念：
将动物一个细胞的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。
用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。
2.原理：
动物细胞核的全能性
4.种类：
胚胎细胞核移植：
体细胞核移植：
细胞分化程度低，表现全能性容易
细胞分化程度高，表现全能性十分困难
3.生殖方式：
无性生殖
因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植
全能性大小：受精卵＞生殖细胞＞体细胞
一、动物细胞核移植技术
在体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难。
主要原因：
①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；
②对非人灵长类动物胚胎操作的技术尚不完善。
我国科学家经过多年努力，攻克了这些障碍，终于成功获得了体细胞克隆猴。
非人灵长类具有许多与人类相似的生物学特征，研究工作中，使用量最多的是旧大陆猴, 其中猕猴属最为重要。
一、动物细胞核移植技术
4.种类：
克隆：是通过无性繁殖的方法产生出来的一群
遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。
2022年中国自主培育的体细胞克隆牛
如何做的？
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（1）选择MⅡ期卵母细胞的原因
①含有促进细胞核表现全能性的物质和营养条件。
②细胞体积大，易于操作。
③卵母细胞内卵黄多，营养物质丰富
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（2）卵母细胞去核方法：
二、体细胞核移植的过程
显微操作（去核）法。通常是显微操作去除纺锤体-染色体复合物。
也可以采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（3）“去核”去的是什么？
去除的为纺锤体-染色体复合物。
去核时，由于MⅡ期卵母细胞核的位置靠近第一极体，用微型吸管一般一并吸出第一极体。
第一极体
次级卵母细胞
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（5）供体细胞注入卵母细胞的优点：
对卵母细胞损伤较小，保证供核不被破坏，操作也更方便。
直接将供体细胞注入去核卵母细胞的透明带内。
（4）去核的原因：
使核移植得到的胚胎或动物核内遗传物质全部来自有重要利用价值的动物。
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（6）重构胚概念：
人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。
（7）激活重构胚的方法:
①物理方法:电刺激
②化学方法:Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制
(8)以上方法处理重构胚的目的
激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程。
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（9）实验结论：
证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。
（10）克隆动物的培养
二、体细胞核移植的过程
并非全在体外，还需在代孕个体 子宫内孕育。
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（11）对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？
多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；
多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。
卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功，将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便。
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
通过显微操作去核
从供体身体某一部位上取体细胞
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
（12）用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？
培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。
因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。
二、体细胞核移植的过程
卵母细胞
C母猴子宫
B母猴
A母猴
成纤维细胞
细胞质
细胞核
早期胚胎
“中中”“华华”
分娩
发育
重组细胞
妊娠
注意：克隆动物属于无性繁殖，遗传物质主要来自于A，一小部分来自于B，与C无关。
证明了动物细胞核具有全能性，卵母细胞的细胞质有助于体细胞核的全能性表达。
二、体细胞核移植的过程
思考·讨论
？
有关体细胞核移植的问题
1.在将体细胞的核移植到卵母细胞之前，为什么必须先对卵母细胞进行去核操作？
为了使核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞。
2.你认为用上述体细胞核移植技术培育的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？
不是对核供体动物进行100%的复制
①克隆动物绝大部分DNA来自供体动物的细胞核，但线粒体中的DNA（细胞质中的DNA）同时来自供体细胞和受体卵母细胞
②性状是基因与环境共同作用的结果，克隆动物所处的环境与核供体细胞生活的环境不会完全相同；
③克隆动物在个体发育过程中有可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异；
二、体细胞核移植的过程
思考·讨论
？
3.体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应用前景的差异。
利用体细胞核移植技术和诱导iPS细胞都能生成干细胞，但它们的过程是完全不同的。
通过体细胞核移植技术可以生成带有核供体细胞遗传物质的胚胎干细胞；诱导iPS细胞需要在细胞中表达几个关键基因，将细胞逆转到类似胚胎干细胞的状态。体细胞核移植技术对核供体细胞有较高要求，一般情况下体细胞的分化程度越高，它重编程为干细胞的成功率就越低；可诱导成为iPS细胞的细胞来源相对广些，研究表明成纤维细胞、B淋巴细胞、脂肪干细胞等都可以诱导成为iPS细胞。体细胞核移植技术涉及采集卵母细胞、去核、融合等复杂的操作；诱导iPS细胞的技术流程相对简单，可能更适合用于生产实践。
目前科学家还在研究由这两种技术生成的干细胞在基因表达、DNA甲基化等方面的差异，这些研究成果也将直接影响它们今后的应用。
有关体细胞核移植的问题
二、体细胞核移植的过程
应用前景
体细胞核移植在畜牧业、医药卫生以及其他领域有着广泛的应用前景。
（1）在畜牧生产中
加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
（2）在医药卫生领域：
①通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；
乳腺生物反应器
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
（2）在医药卫生领域：
②在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体；
③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们一直给患者时可以避免免疫排斥反应。
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
（3）在科研领域：
①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；
②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；
③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。
（4）在保护濒危物种方面：该技术有望增加濒危物种的存活数量
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
①成功率非常低，各个技术环节也有待进一步改进；
②相对于技术研究,核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合；
③一些研究者指出，绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。
存在的问题
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
动物细胞培养要经过脱分化过程吗？为什么？
脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。
动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
1、下列关于高产奶牛克隆过程的叙述，错误的是
A.供体牛体细胞在进行体外培养时会发生细胞贴壁和接触抑制的现象
B.培养至M Ⅱ中期的卵母细胞的细胞质中含有能促进细胞核全能性表达的物质
C.通过电融合法促进供体与去核受体细胞两两融合，供体核进入卵母细胞
D.胚胎移植时，应将重组细胞直接移入代孕母牛的子宫
2、在目前现有技术条件下，科学家还不能将从动物体内分离出来的成熟的体细胞直接培养成一个新个体，而是必须将体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中才能发育成新个体。你认为哪个是最可能原因
A.卵细胞大，便于操作
B.卵细含有的营养物质多
C.卵细胞的细胞质可使体细胞细胞核全能性得到表达
D.重组细胞才具有全能性
D
练习
C
3、下列对动物核移植技术的描述不正确的是
A.哺乳动物核移植包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎核移植
B.体细胞核移植的过程中可通过显微操作去核法去除卵母细胞中的核
C.体细胞核移植过程中通常采用去核的MⅡ期卵母细胞作为受体细胞
D.通过体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制
D
练习
4、图为科研人员培育克隆猴“中中”的流程图。下列有关叙述正确的是
A.e的性状表现不受来源于b中的基因控制
B.图中涉及的技术有动物细胞培养、核移植、胚胎移植等
C.d为胚胎发育提供遗传物质和其他适宜条件
D.e的诞生体现了a细胞的全能性
B
能 力 提 升
练习
5、治疗性克隆有望解决供体器官的短缺和器官移植出现的排异反应等问题。如图表示治疗性克隆的过程，下列有关叙述不正确的是
A.上述过程利用了动物体细胞核移植和动物细胞培养等技术
B.上述过程中充分说明体细胞核移植技术已完全成熟
C.①过程的完成离不开胚胎干细胞的增殖和分化
D.①②过程都发生了DNA分子的复制和蛋白质的合成
B
练习
概念检测
1、假设世界上最后一头野驴刚死亡，以下使它"复生"的方案中可行的是
A.将野驴的基因导入家驴的受精卵中，培育出新个体
B.将野驴的体细胞取出，利用组织培养培育出新个体
C.将野驴的体细胞两两融合，再经组织培养培育出新个体
D.将野驴的体细胞核移植到家驴的去核卵母细胞中, 经孕育培育出新个体
D
概念检测
2、2017年，某国批准了首例使用细胞核移植技术培育"三亲婴儿"的申请。其培育过程可选用如下技术路线。据图分析下列叙述错误的是
C
A.该技术涉及动物细胞培养、细胞核移植等操作
B.该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代
C.卵母细胞捐献者携带的红绿色盲基因能够遗传给"三亲婴儿"
D."三亲婴儿"同时拥有自己父亲、母亲及卵母细胞捐献者的部分基因
拓展应用
1.大熊猫是我国的国宝。尽管我国政府采取了许多保护措施，但由于大熊猫的繁殖能力低，幼仔成活率也低，它的数量仍然非常少。有科学家尝试采用体细胞核移植技术来克隆大熊猫。请你结合本节所学内容并搜集相关资料了解这方面的研究进展。也有人不赞成进行克隆大熊猫的研究，认为保护大熊猫的最好措施就是保护现有大熊猫及其生存环境, 对此你有什么看法
是否赞成克隆大熊猫，只要言之有理，无论赞成还是反对克隆大熊猫的研究，都应该保护好大熊猫的生存环境，否则即使成功克隆了大熊猫，它们没有适宜的生存环境，也可能走向灭绝。
拓展应用
2. 2003年，世界上第一只用体细胞克隆的动物——多莉，因患有严重的肺部疾病被实施了安乐死。它只活了7岁，而普通绵羊的平均寿命在12岁左右。多莉的死亡引发了关于克隆动物是否早衰的争论。一些研究者认为，克隆动物的端粒比较短，基因表达不正常，早衰是一种必然现象。另一些研究者则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中的一些技术问题造成的;或者克隆动物在发育过程中出现了变异，早衰只是偶然现象。请你搜集资料，寻找支持各方观点的研究证据。你也可以调查克隆动物存在的其他问题，并说明科学家是如何解决这些问题的。
在搜集证据的过程中，要注意证据的来源及其真实性和可靠性，虽然目前对克隆动物的早衰问题存在争论，但这样的争论有利于人类进一步了解生命现象，也有利于克隆技术更好地应用于医疗、农牧业等领域。
谢谢观看！

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