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第二章
细胞工程
2.2.1 动物细胞培养
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
通过细胞培养构建的人造皮肤
讨论：
怎样才能获得大量的自体健康皮肤？
能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
既解决了来源不足，又不会产生排斥反应
人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都离不开动物细胞的培养。
动物细胞工程
动物细胞培养（基础）
动物细胞融合技术和单克隆抗体
动物体细胞核移植技术和克隆动物
1.动物细胞培养的条件
2.动物细胞培养的过程
3.干细胞培养及应用
一、动物细胞培养的条件
操作原因：
原理：
对象：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
细胞增殖
一般是指动物胚胎或出生不久的幼龄动物组织，因为这些组织细胞比老龄动物的组织细胞生命力旺盛，易于培养，同时增殖能力也更强。
将组织块分散成单个细胞后，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出。
目的：获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
一、动物细胞培养的条件
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件。你还记得有哪些条件吗？
充足的营养
稳定的内环境
体外培养动物细胞需要满足什么条件？
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 ……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH
和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养的条件
将细胞所需的营养物质（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按种类和所需量严格配制的培养基。
1.营养条件
（1）培养基构成：
合成培养基
血清等一些天然成分
＋
合成培养基：
血清等一些天然成分：
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。
（2）培养基类型：
一般使用液体培养基
（培养液）
血清
一、动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养的条件
1.营养条件
1.血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。
2.氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。
3.血清中有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。
4.因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。
补充资料：
一、动物细胞培养的条件
无菌：
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液。
无毒：
③可添加一定量的抗生素
目的：以便清除代谢物，
防止细胞代谢物积累对细胞自身造成伤害。
一、动物细胞培养的条件
2.无菌、无毒的环境
3.温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以 为宜；
36.5±0.5℃
（2）适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为 ；
7.2-7.4
（3）适宜的渗透压：
目的 。
维持细胞正常的形态和功能
与相应动物内环境的理化性质保持一致。
对比
人体内环境的理化性质
①人体细胞外液的温度一般维持在：
36.5±0.5℃
②正常人的血浆近中性，pH约为：
7.35~7.45
③渗透压：指溶液中溶质微粒对水的吸引力。
在37℃时，人的血浆渗透压约为：
770 kPa
一、动物细胞培养的条件
4.气体环境
（1）气体组成及作用：
O2
CO2
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）具体操作：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
CO2培养箱
一、动物细胞培养的条件
1、一般来说动物细胞体外培养需要满足的条件是
①无毒的环境； ②无菌的环境；
③合成培养基需加血清； ④温度与动物体温相近；
⑤需要O2 ，不需要CO2； ⑥用CO2 调节培养液pH
A.①②③④⑤⑥ B.①②③④
C.①③④⑤⑥ D.①②③④⑥
2、用动植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是
A.都需要用含95%空气和5%CO2的混合气体的培养箱
B.都需要用液体培养基
C.都要在无菌条件下进行
D.都可体现细胞的全能性
练习
D
C
动物组织处理——制成细胞悬液
1、将组织分散成单个细胞
①方法：
机械法
用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
②原因：
成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖
一是能使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需要的营养供应；
2、用培养液将细胞制成细胞悬液。
二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中进行原代培养。
原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
二、动物细胞培养的过程
③优点：
【问题探究1】进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
【问题探究2】胰蛋白酶会把细胞膜蛋白分解掉吗？
可能会
控制好作用时间
二、动物细胞培养的过程
体外培养的动物细胞可以分为两大类：
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；
另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
悬浮培养瓶
形成一层细胞
可形成多层细胞
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。
接触抑制：
肿瘤细胞失去接触抑制，在培养液可以无限增殖下去。
二、动物细胞培养的过程
细胞贴壁过程
圆球形细胞刚开始
铺展贴壁生长（100×）
培养的动物细胞贴壁生长
并进行有丝分裂（100×）
细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×）
贴壁生长与接触抑制
二、动物细胞培养的过程
3.分瓶、进行传代培养
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象。这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
（1）悬浮生长类：直接用离心法收集。
（2）贴壁生长类：需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。
之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
二、动物细胞培养的过程
传代培养：将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
取动物组织
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：大多数细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
二、动物细胞培养的过程
传代培养
部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止
大部分细胞衰老死亡
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，
获得不死性，这些细胞已经发生了突变，
正朝癌细胞发展
10~50代
继续培养
（50代以后）
使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)；
这一阶段的细胞称为细胞株
遗传物质一定改变了
这一阶段的细胞称为细胞系
二、动物细胞培养的过程
拓展1：核型
核型是指一个体细胞中的全部染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
二、动物细胞培养的过程
有关动物细胞培养的问题
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。
同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。
从培养原理、所需营养条件、环境条件以及培养过程等方面分析比较。
二、动物细胞培养的过程
思考·讨论
？
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的物理性质
培养基的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开。
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分；无机营养成分；植物激素。
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清。
植物激素
血清
二、动物细胞培养的过程
有关动物细胞培养的问题
思考·讨论
？
植物组织培养 动物细胞培养
特殊环境条件
结果
是否体现全能性
过程
相同点 再分化需光
气体环境
一般获得新的植株
获得大量细胞
是
否
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
幼苗
完整植株
移栽成活
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
二、动物细胞培养的过程
有关动物细胞培养的问题
思考·讨论
？
3、相对细菌和植物细胞而言，动物细胞离体培养更需关注培养基的渗透压，这是因为动物细胞
A.没有中央液泡，不能发生渗透作用
B.渗透压远高于细菌或植物细胞的渗透压
C.没有细胞壁，易吸水涨破
D.生长缓慢，各生长阶段对环境的渗透压要求不同
4、下列关于动物细胞培养的叙述不正确的是
A.动物细胞培养技术的原理是细胞膜的流动性
B.传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞
C.癌细胞在培养瓶中不会出现接触抑制现象
D.动物细胞培养一般需要使用CO2培养箱
C
A
练习
5、动物体内细胞能够维持正常的生命活动是因为机体给细胞提供了适宜的条件，在体外培养细胞时也需要满足类似条件。下列有关体外培养动物细胞的说法，错误的是
A.培养动物细胞时，CO2的作用主要是维持培养液的pH
B.在培养瓶中，大部分细胞悬浮在培养液中生长增殖
C.与老龄动物的细胞相比，幼龄动物的细胞更易于培养
D.在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集
6、下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是
A.动物细胞培养需要的气体主要有CO2和O2，目的是维持细胞呼吸对气体的要求
B.原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长减缓停滞
C.传代培养时，少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，其遗传物质发生了改变
D.动物细胞培养过程中会出现接触抑制现象
B
练习
A
7、如图所示为动物细胞培养的基本过程，下列关于甲、乙、丙、丁四个操作过程的叙述，正确的是
C
A.甲过程可选取动物个体的任何组织细胞
B.乙过程可用纤维素酶和果胶酶处理细胞
C.丙过程所用培养液中需添加动物血清
D.丁过程中的细胞因接触抑制而大量死亡
练习
8、完成下列问题：
（1）过程①处理方法有:_____________________。
（2）过程②为_____________________________
（3）培养的动物细胞有两类:
①悬浮在_______中生长增殖;
②___________________生长增殖。
（4）过程③为_____培养,进行过程③的原因主要有:细胞密度过大、___________积累、_________缺乏和接触抑制等。
（5）进行过程③时,悬浮培养的细胞直接用_______收集;贴壁细胞需要使用
_________等处理,然后用_______收集。
机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法
转入培养液中进行原代培养
培养液
贴附于某些基质表面
离心法
胰蛋白酶
离心法
传代
有害代谢物
营养物质
练习
9、右图为动物细胞培养过程示意图，请回答以下几个问题：
（1）容器A中的动物器官或组织首先要剪碎，然后用胰蛋白酶处理，其目的是______________________。
（2）培养先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有葡
萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和_________等。当
细胞分裂生长到_________时，就会停止增殖，需用
胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，称为_________。
（3）有一类不正常的动物细胞，体外培养不受接触
抑制机制的制约而表现为“疯长”这类细胞最可能是
_______。
使组织分散成单个细胞
动物血清
相互接触
传代培养
癌细胞
练习
干细胞：
干细胞存在于_________、______和_______等
多种组织和器官中
早期胚胎
骨髓
脐带血
①胚胎干细胞
②成体干细胞
干细胞
三、干细胞培养及其应用
动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。
1.胚胎干细胞
（简称ES细胞）
①分布：
②特点：
③应用实例：
④局限性：
存在于早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
目前科学家已分离出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES细胞，在体外培养可分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等细胞。
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
体积小，细胞核大、核仁明显。也叫做全能干细胞。
三、干细胞培养及其应用
2.成体干细胞
①分布：
③特点：
②常见类型：
存在于成体组织或器官内的干细胞
造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
神经干细胞（神经系统中）
精原干细胞（睾丸中）
发现最早
研究最多
应用最成熟
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，
不具有发育成完整个体的能力。
单能干细胞
多能干细胞
三、干细胞培养及其应用
④作用：
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
⑤应用实例：
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
造血干细胞
神经干细胞
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
⑥面临的问题：
用于临床治疗存在导致肿瘤发生的风险
⑦应用展望：
2．成体干细胞
三、干细胞培养及其应用
3.诱导多能干细胞
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞）。
①借助载体将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞均可）；
②用小分子化合物诱导形成。
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
iPS细胞
三、干细胞培养及其应用
①概念：
②诱导方法：
③优点：
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
可治疗镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
三、干细胞培养及其应用
④应用：
3.诱导多能干细胞
来源或存在 功能、特点 局限性
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞
诱导多能干细胞(iPS细胞)
早期胚胎
能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体
成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等
体外诱导体细胞产生
能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。
具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织
不具有发育成完整个体的能力
需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用
技术不成熟。
三、干细胞培养及其应用
三种干细胞比较
10、动物和人体内具有分裂和分化能力的细胞称为干细胞。下图的相关叙述中，错误的是
A.a过程表示干细胞能自我更新，主要通过有丝分裂实现
B.b、c过程表示干细胞具有分化能力、是遗传信息执行情况不同的结果
C.通过b、c过程形成的两种细胞中不可能含有相同的蛋白质
D.通过a、b、c过程形成的三种细胞一般都具有相同的遗传信息
C
练习
11、干细胞是一类未参与分化或未完全分化的细胞，分裂能力强。按照其来源分为胚胎干细胞和成体干细胞(如造血干细胞、神经干细胞)。下列关于干细胞的说法错误的是
A.胚胎干细胞不具有发育成完整个体的潜能
B.胚胎干细胞的分化程度小于造血干细胞
C.骨髓移植治疗白血病就是利用了造血干细胞能分化成各种血细胞的能力
D.将带有遗传标记的胚胎干细胞植入早期胚胎，通过组织化学染色可追寻胚胎发育中细胞分化和器官形成的规律
A
练习
12、某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，若后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的
A.用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性
B.用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病
C.如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术
D.如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物
C
练习
13、下图是胚胎干细胞分离途径示意图。下列说法中正确的是
A.胚胎干细胞来源于早期胚胎或原始性腺
B.胚胎干细胞可用于治疗人类的各种疾病
C.胚胎干细胞可以无限增殖
D.利用胎干细胞培育的人造器官正在大规模应用
A
练习
课堂小结
动物细胞培养
动物细胞培养的概念和原理
干细胞培养及其应用
营养条件；无菌、无毒的环境；温度、pH和渗透压；气体环境
原理：细胞的增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
干细胞的分布
干细胞的类型
干细胞的应用
胚胎干细胞（ ES细胞）
成体干细胞
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
主要应用在医学上
概念检测
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖
×
√
×
×
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
A
拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。
该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
谢谢观看！

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