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(共28张PPT)
微生物的计数
高中微课程
一、实验目的
了解不同微生物计数的操作流程，掌握血球计数板的计数和操作规范，重点掌握血球计数法和平板活菌计数法。
二、实验器材：
酵母菌贮用培养液、大肠杆菌贮用培养液、血细胞计数板、细菌计数板、比浊计（或比色计）、有螺旋盖的试管、显微镜等。
2、仪器： 恒温培养箱、恒温摇床、离心机、搅拌器、冰箱等。
三、实验原理：
计数板计数的原理通过对计数室中的微生物数量的读取，计算原溶液中的微生物数量；平板菌落计数的原理是每个菌落大部分是由个单细胞生长繁殖而来，根据菌落的数量推测出微生物的数量。
血球计数法
1、实验原理：
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面刻有一定面积的
方格，将盖玻片盖上后，由于两者之间存在着距离使之形成一定容积的小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成单位体积的样品中所含的菌数。
2、血球计数板的构造
盖玻片
0.1mm
1/400mm2
计数室体积
=(1×1×0.1)mm3
= 10-4cm3
血球计数板
3、血球计数法的步骤
1、取待测啤酒酵母菌液，摇匀。并做适当稀释（以每个中格内20左右为宜）。
2、取洁净干燥的血球计数器，盖上盖玻片，用滴管吸取少量菌液沿盖玻片边缘滴入一小滴，菌液自行渗入计数室，静止片刻，使菌液均匀充满每小室。
3、先在低倍镜下找到计数室，注意光线不能太亮，再转到高倍镜下，取5个中格进行计数（每个中格取4个小格）。
计数时注意调节焦距，使不同焦距的菌体都计入，在线上的菌，数上不数下，数左不数右。
4、菌液浓度计算
菌液浓度（菌数/ml)=N×25×104×稀释倍数
其中N为每中格内菌数的平均值。
1. 每个血细胞计数板的正中央有2个计数区。各9个大方格（中央为红细胞计数区，4个角为白细胞计数区）
2. 红细胞计数区共400个小方格。
①大方格：_____个。长、宽各1 mm。1个大方格液体体积＝1 mm2×0.1 mm＝0.1 mm3(0.1×10-3mL)。
②中方格：红细胞计数区又用双线分成______(或16)个中方格。
③小方格：每个中方格再用单线划分为______(或25)个小方格。所以一个计数区共有 个小方格。
(4)计数时的几个注意点
①滴加菌液要避免菌液滴到盖玻片上并防止 ，
以免影响计数结果。先盖盖玻片再滴加菌液，让菌液自行渗入，
②对有25个中方格的红细胞计数区可采用_________法对酵母细胞进行计数。
9
25
16
400
产生气泡
“五点取样”
酵母细胞进行计数。
③在计数每一小方格中的细胞数时，为了避免重复计数压在小方格边缘线上细胞的数目，应_____________________________。
④为了保证结果的可信度，消除误差，应对同一红细胞计数区中的细胞数进行_____ 次计数后取平均值，再按比例进行换算。
小思考：显微镜直接计数法有什么缺点吗？
【答案】不能区分死菌和活菌；计数结果较实际活菌偏大
⑤用血细胞计数板对酵母菌计数时，吸取培养液前要轻轻振荡几次试管的目的是 。
“数上不数下”“数左不数右”
3
使酵母菌分布均匀，计数准确
平板活菌计数法
1、实验原理
微生物在固体培养基上形成的单菌落，一般认为是由一个细胞繁殖而来，及一个菌落代表一个细胞。计数时，将待测菌样做一系列稀释，再取一定稀释度一定量的稀释液接种到平板上，使其均匀分布。经培养后，生长成单菌落，由菌落数推算出单位体积菌液的活菌数。
2、平板活菌技术的步骤
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
菌悬液 10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
每皿约倒入15ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
沙保培养基
待凝后倒置于28℃恒温培养48h后计数。
（选择菌落数在50～100个左右的平板计数）
菌液浓度计算
菌液浓度（菌数/ml) =菌落数×稀释倍数×5
注：只数浓度合适的两个平板取平均值
2.
3.
4.
5.
注意事项
1.
过程的无菌操作
稀释分离法中熔化后的培养基倒平板前温度控制
稀释法中用吸管取试管中液体的顺序从稀到浓
取样前注意摇匀待测菌液
取样时都要无菌操作。注意取菌液时移液管不要
碰到火焰，以免烧死菌体
6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡
7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
思考题
１.从两种方法计数得出的菌液浓度是否一
致？分析误差产生的原因，由此比较一下
两者的优缺点及 各自的适用范围。
２.平板活菌计数中，为何选择生长有50～
100个菌 落的平板？
例：将1g土样加到盛有99ml无菌水的三角瓶中，如图进行稀释，每个稀释度涂布三个平板，根据结果计算1g土样中菌的数量？
(159+141+150)÷3
×10×103×102
=1.5×108个/g
比浊法
微生物细胞在一定浓度范围内,与浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。故可通过分光光度计测定吸光值，通常测定600nm下的吸光值OD600，通过与标准曲线对比，求出样品中菌液浓度，计算出细胞的数量。 实验测定时容易出现误差，必须控制菌浓度在与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。
霉菌计数法
对于霉菌的计数一般比较困难,由于霉菌生长快,菌丝叠加导致无法准确计数.国标霉菌计数法的原理是:将待测菌液进行10 倍梯度系列稀释,利用高盐察氏培养基(CAO)与待测菌液混匀后倒平板,25一28℃下培养3d 后开始计数,选择菌落数在10-150 之间的平板进行计数,取同稀释度的两个平板的菌落平均数乘以稀释倍数,即为每g(或 mL)检样中所含霉菌数。
凯氏定氮计数法
蛋白质是微生物细胞的主要成分,含量较稳定,可以通过测定样品中含量稳定的蛋白质的量计算细菌的数量,将细胞洗涤收集,用凯氏定氮法测全氮,蛋白质含氮量为16%,细菌中蛋白质含量因种类的不同而有差别,平均值为65%,微生物细胞内的蛋白质总含量可以计算出待测样品中细胞的总质量,最后根据单个细胞的质量计算出样品的细胞数量。
总含氮量与蛋白质之间的关系为:蛋白质总量= 含氮量除以16%,那么,微生物细胞总质量=蛋白质总量 除以65%,微生物细胞总数=细胞总质量除以单个细胞所含蛋白质的质量,单个细胞的蛋白质质量都有差别,所以用此方法测定的结果误差较大,只能作为参考。
DNA含量测定法
每个微生物细胞的 DNA 含量非常恒定，平均为8.4-10 ng，将一定体积的细菌悬液离心，从细菌细胞中提取DNA，得其重量， 则可计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。
血球计数法的操作流程及要求
血细胞计数板的结构介绍注意事项
移液枪的使用方法
超净台的使用规范
水浴锅的使用方法
涂布平板法的操作规范
课时总结
比浊法的操作规范
霉菌计数法的操作规范
凯氏定氮计数法的操作规范
DNA含量测定法的操作规范
同学们，再见

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