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(共32张PPT)
第1节 重组DNA技术的基本工具
第三章　基因工程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
基因工程的发展历程
基因工程
对象
原理
优点
基本过程
基因
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
基因重组
剪切→拼接→导入→表达
基因工程
指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
1．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
减数分裂I前期，同源染色体上非姐妹染色单体间的互换；
减数分裂I后期，非同源染色体上非等位基因的自由组合。
2. 为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
3. 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(3)都遵循碱基互补配对原则
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
从社会中来
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
“分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
磷酸二酯键
1.来源：
2.功能：
3.作用的化学键：
主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
识别双链DNA特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
磷酸二酯键
原核生物
（专一性）
EcoRⅠ
限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
4、作用结果：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶(EcoRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开
键,形成 末端。
-GAATTC-
-CTTAAG-
G
A
黏性
磷酸二酯
EcoR I
5'
5'
3'
3'
黏性末端
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出（未配对）的核苷酸，这样的切口叫黏性末端。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
错位切
能被限制酶特异性识别的序列一般都为回文序列，也就是说，在该序列片段，一条链上按5’→3’读取的序列完全一致。
特点1：都可以找到一条中（心）轴线；特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的
4、作用结果：
Sma I
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶(SmaⅠ)能识别 序列,并在 和 之间切割形成 ___末端 。
-CCCGGG-
-GGGCCC-
G
C
平
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
作用结果:
形成黏性末端和平末端
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
平切
限制酶名字的由来
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
资料卡
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
不能。
可断开2个磷酸二酯键；
产生2个游离的磷酸基团；
产生2个黏性末端；
消耗2分子水。
限制酶只能识别并切开双链DNA分子
酶的专一性
(2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？
产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
2.你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
3.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
4.写出下列限制酶切割形成的末端序列
BamHⅠ EcoRⅠ__________________________
Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
-G
-CCTAG-
-G
-CTTAA-
-A
-TTCGA-
-A
-TCTAG-
or
-GATCC
G-
or
-AATTC
G-
or
-AGCTT
A-
or
-GATCT
A-
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
注：即使用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的粘性末端相同就可用DNA连接酶连接起来。
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
T G A A T T C G
A C T T A A G C
A G A A T T C T
T C T T A A G A
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
1.作用：
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！
种类 ___________________
___________________
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用
差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端
（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
2.种类：
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
思考: DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——“分子缝合针”
与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 限制酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 单个的脱氧核苷酸 DNA DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成重组DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 切割DNA分子形成黏性末端或平末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
判断下列是否正确
(1)限制酶只能用于切割目的基因(　　)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(　　)
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　)
(5)限制酶和解旋酶作用部位相同(　　)
×
×
×
×
×
质粒
①将外源基因送入受体细胞。
②携带外源DNA片段的护理进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
动植物病毒
噬菌体
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
大肠杆菌及质粒结构模式图
裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
1.作用：
2.种类:
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
大肠杆菌及质粒结构模式图
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
有一个至多个限制酶切割位点
具有特殊的标记基因
无毒害作用
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
可携带多个或多种外源基因
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”
3.载体需具备条件
拓展延伸：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：
也可以用荧光蛋白基因做标记
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
重组DNA分子
思考.讨论
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
重组DNA分子
思考.讨论
2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源 ：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
一、实验原理：
（1）粗提取DNA的原理:
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
①在酒精溶液中的溶解性：
②在NaCl溶液中的溶解性：
DNA不溶于(冷)酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（2）鉴定DNA的原理:
在一定温度（沸水浴）下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
二、实验材料及用具：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
1.选材：
问题:能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
2.试剂：
试剂
研磨液
体积分数为95%的酒精
二苯胺
2mol/L 的NaCl溶液
蒸馏水
溶解并提取DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
二、实验材料及用具：
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
冷酒精析出DNA
DNA的鉴定（沸水浴、二苯胺）
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
纱布过滤取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液(或离心后取上清液）。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
三、实验步骤：
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
四、注意事项：
①以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
②利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
③加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。
④加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
⑤预冷的酒精具有以下优点：a.可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；b.抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；c.低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
思考·讨论：
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。
从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A. 大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
练习与应用

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