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微专题18 基因编辑、酵母双杂交和蛋白质工程
考点1　基因编辑
【典例剖析】
1.(2022·福州高三期末)单细胞生物并没有免疫系统，但是科学家发现细菌中存在清除入侵病毒DNA的功能系统，并发明了CRISPR/Cas9基因编辑技术。该系统主要包含单链向导RNA和Cas9蛋白两个部分，能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。请回答下列问题：
(1)如图为CRISPR/Cas9系统作用示意图，该系统能精准识别相关基因的原理是单链向导RNA与目标DNA发生________________，Cas9蛋白可催化____________(化学键名称)水解，剪切特定DNA片段。
(2)CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物中，细菌这种清除入侵病毒DNA的生理意义是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)真核生物中没有编码Cas9蛋白的基因，若要对真核生物的基因进行编辑，要借助现代生物技术将CRISPR/Cas9基因导入相关细胞，此项技术的原理是____________。
(4)水稻不育系的选育是杂交水稻育种工作中的关键环节，TMS5基因是控制水稻育性的关键基因。为了获得某水稻品种的不育系，研究人员对该水稻品种的TMS5基因进行编辑。
①Cas9蛋白将TMS5基因剪切后，断裂后的DNA分子会自动进行修复，修复过程中断点处插入碱基A之后两个片段在____________酶作用下得到编辑成功的TMS5基因，此过程导致的变异属于____________。
②在编辑成功的TMS5基因上游连接启动子后组装形成基因表达载体。再通过农杆菌侵染水稻愈伤组织，并整合到水稻细胞的____________上，愈伤组织再经过________过程形成水稻幼苗。
③基因编辑中插入碱基A，会导致翻译提前终止，使TMS5基因表达的蛋白质不能产生，最终导致水稻花粉不育。用抗原—抗体杂交技术检测TMS5基因编辑是否成功，若________(填“出现”或“未出现”)杂交带，则表明基因编辑成功。
(5)华人科学家张锋是首个将CRISPR基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞的科学家，为此项技术广泛应用于生命科学和医学领域作出了不可磨灭的贡献。但是更多的学者提出了CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，实验发现RNA的序列长短影响成功率，越短脱靶率越______。试分析脱靶最可能的原因是__________________。
【关键点拨】
1．基因编辑的含义
对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。
2．应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9基因编辑技术。
3．CRISPR/Cas9的组分及功能
短链RNA(sgRNA、向导RNA) 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合
细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂
4.CRISPR/Cas9技术的主要应用
(1)基因敲除；
(2)特异突变引入；
(3)定点转基因。
5．CRISPR/Cas9技术的风险
(1)基因编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。
(2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。
【巩固练习】
1．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，科研人员对其进行了一系列改造。
(1)Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图1)。复合体中的________与目的基因特异性结合，________切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基，从而引发_________________________________________________。
(2)将编码Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，与Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但与sgRNA结合等功能不变。构建能够表达dCas9蛋白的质粒A，设计一系列与红色荧光蛋白基因(RFP基因)上游不同部位结合的sgRNA序列(如图2)，并以此为依据构建能表达sgRNA的质粒B，将质粒A、B共同导入含有RFP基因的大肠杆菌，测定大肠杆菌红色荧光强度，实验结果如图3所示。
实验结果显示，对照组的红色荧光强度约为sgRNA 3组的________倍。由实验结果可以得出：______________________________________________________________________________。
(3)VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段。科研人员欲利用上述系统和VP64蛋白促进特定基因表达，请设计促进细胞中已存在的基因X表达的方案。
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
(4)请写出CRISPR/Cas9及其改造产品在科学研究中的应用___________________________
______________________________________________________________________________。
2．CRISPR/Cas9基因编辑系统由sgRNA和Cas9蛋白(能够切割DNA的酶)组成。CRISPR/Cas9系统作用原理如图所示，请回答下列问题：
(1)将sgRNA基因和Cas9编码基因重组到质粒并利用____________技术导入受精卵，在受精卵内sgRNA基因通过________产生sgRNA，Cas9编码基因通过____________产生Cas9蛋白。sgRNA和Cas9蛋白共同构成基因编辑系统，对靶向基因实现定点编辑。可通过________技术在体外获得大量的Cas9编码基因。
(2)据图可知，sgRNA是一段________________________________的单链RNA，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
(3)靶向基因中的PAM序列是sgRNA的重点识别区域，以帮助Cas9蛋白实现对靶基因的切割和后续编辑。由于________________________，因此CRISPR/Cas9基因编辑技术能够对大多数基因进行定点编辑。
考点2　酵母双杂交和蛋白质工程
【典例剖析】
2.(2023·天津高三质检)甜柿鲜果肉中含丰富的可溶性糖、微量元素、维生素和β－胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者喜爱。甜柿自然脱涩的涩味程度与乙醛代谢关键酶基因(PDC)的表达情况有关。为筛选PDC基因调控蛋白，科研人员利用质粒A和质粒G(如图甲、图乙所示)，进行了相关研究。
(1)启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，同时启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响了基因的________水平。
(2)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在的片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在__________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据__________________________________设计引物进行PCR扩增，在扩增过程中使用的DNA聚合酶具有________的特点，在该酶的作用下可以将4种脱氧核苷酸加到引物的一端。
(3)AD基因表达出的 AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含____________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1。将从甜柿中提取的总mRNA经逆转录合成不同片段的cDNA，然后分别插入质粒G中的__________(填序号1～5)位点以获得不同的重组质粒(G1、G2……)，理由是___________
______________________________________________________________________________。
(4)将携带不同 cDNA 片段的重组质粒 G1 、G2……分别导入酵母菌 Y1 中，然后分别置于含____________的培养基上培养。若能在培养基上生长，则该酵母菌含有的cDNA 所表达的蛋白质即为PDC基因调控蛋白。请结合图丙简述作出该推测的理由：_________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(5)筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于蛋白质工程，该工程是指以______________________________________作为基础，通过对______的修饰或合成，对现有蛋白质进行改造，或制造出一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，该工程的起点是_______________________________________________________。
【关键点拨】
1．酵母双杂交原理
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与，真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA binding domain，DNA－BD)和DNA转录激活结构域(Activation domain，AD)，这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录。根据这一原理，可设计酵母双杂交系统。
将两待研究蛋白(蛋白X与蛋白Y)分别与BD、AD结构域构建融合质粒。将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达，如果两蛋白之间不存在相互作用，则下游基因(报告基因)不会转录表达；如果两个蛋白存在相互作用，则BD与AD两结构域空间上很接近，从而下游基因(报告基因)得到转录。通过报告基因表达与否，即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。原理如图所示。
2．蛋白质工程
【巩固练习】
3．(2023·南通高三调研)酵母双杂交技术是筛选能与已知蛋白互作的蛋白质的方法，其主要原理如图1。黄瓜花叶病毒(CMV)可侵染200多种植物，病毒的外壳蛋白(CMV CP)直接参与病毒的细胞间转移、症状表现等。研究人员利用酵母双杂交技术，从CMV感染的番茄叶片cDNA文库中筛选出CMV CP互作蛋白基因，图2为构建CMV CP诱饵载体(能表达出BD－CP融合蛋白)的流程。请据图回答下列问题：
(1)图1中，获得BD－X蛋白的关键是将相应序列连接形成融合基因。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到启动子上，进而招募酶X催化LacZ基因的转录，酶X是
________________。
(2)图2中，过程①提取总RNA时选择有明显感染症状叶片的原因是________________。过程②中通常利用RT－PCR技术获得cDNA，上述技术中不同循环次数的扩增产物电泳结果如图3，则最适宜的循环次数是________次，依据是___________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)图2过程③构建诱饵载体时，为保证CP cDNA能定向插入到指定位置，需要在过程②设计PCR引物时，______________________________________________________________。用获得的诱饵载体先转化大肠杆菌，再用____________法将菌液接种到含________的选择培养基上，挑取阳性单菌落细胞进行测序，确认插入的基因序列正确。
(4)获得CMV CP诱饵载体转化的酵母菌后，研究人员进一步开展CMV CP互作蛋白的筛选研究，其主要实验流程是：构建感染CMV的番茄cDNA文库→构建一系列靶蛋白载体→______________________________________→接种培养，获取呈________色的菌落细胞→筛选、鉴定互作蛋白。
4．(2022·湖南，22)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________________，物质b是__________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______________、______________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是__________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是
________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。
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参考答案
考点1
典例剖析
1．(1)碱基互补配对　磷酸二酯键　(2)防止外源基因插入并表达，保证了细菌遗传性状的稳定　(3)基因重组　(4)①DNA连接　基因突变　②染色体DNA　再分化　③未出现　(5)高　其他DNA序列也含有与向导RNA互补配对的序列，造成向导RNA错误结合而脱靶
巩固练习
1．(1)sgRNA　Cas9蛋白　基因突变　(2)100　sgRNA结合部位距离转录起始点越近，抑制目的基因表达的作用越强　(3)根据基因X的序列设计sgRNA，使其能识别X基因的RNA聚合酶识别序列，让VP64蛋白与该sgRNA结合形成复合体　(4)可实现定点诱变、特异性抑制某些有害基因或致病基因的表达
解析　(1)sgRNA可通过碱基互补配对与目的基因特异性结合，进而特异性地识别目的基因；随机插入、删除或替换部分碱基将导致基因结构的改变，属于基因突变。(3)VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段，而sgRNA具有识别作用，可根据基因X的序列设计sgRNA，使其能识别X基因的RNA聚合酶识别序列，让VP64蛋白与该sgRNA结合形成复合体。
2．(1)显微注射　转录　转录和翻译(表达)　PCR　(2)能与靶向基因上的特定序列互补配对　(3)大多数基因中都含PAM序列
解析　(1)将目的基因导入动物细胞利用显微注射技术。在受精卵内sgRNA基因通过转录产生sgRNA，Cas9编码基因通过表达(转录和翻译)产生Cas9蛋白。可通过PCR技术在体外大量扩增目的基因。(2)据图可知，sgRNA是一段能与靶向基因上的特定序列互补配对的单链RNA，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合。(3)靶向基因中的PAM序列是sgRNA的重点识别区域，由于大多数基因中都含PAM序列，因此CRISPR/Cas9基因编辑技术能够对大多数基因进行定点编辑。
考点2
典例剖析
2．(1)转录　(2)DNA连接酶　接头片段和PDC基因编码序列　耐高温　(3)尿嘧啶　2　插入位点需要在AD基因的启动子和终止子之间，且不能破坏AD基因　(4)金担子素　 待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性　(5)蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系　基因　预期蛋白质的功能
巩固练习
3．(1)RNA聚合酶　(2)感染症状明显的叶片细胞中含有大量CMV病毒，有丰富的CMV CP基因　18　2号条带比1号条带宽，而3号条带较弥散(或2号条带最明亮、整齐)　(3)在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ识别序列　稀释涂布平板　卡那霉素　(4)分别将靶蛋白载体导入诱饵载体转化后的酵母菌　蓝
解析　(3)由图2可知，CP基因插入到BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间，所以引物设计需要在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ识别序列；接种菌液用稀释涂布平板法，载体上的标记基因是卡那霉素抗性基因，所以培养基中添加卡那霉素。
4．(1)氨基酸序列(多肽链)　mRNA　密码子的简并性　(2)从基因文库中获取目的基因　通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　DNA半保留复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理所用的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏　(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间
解析　(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大。水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定；经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降。经酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，且差异明显。据此推测两种酶处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。

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