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(共30张PPT)
二、微生物的纯培养和计数
纯培养：
获得由单一个体繁殖所得的微生物群体(单菌落)的过程。
微生物群
分散或稀释
单个细胞
繁殖
单菌落
酵母菌的纯培养
原理：
方法：平板划线法和稀释涂布平板法
不同菌落的形状、大小、颜色等不同。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
材料用具：
微生物纯培养过程包括：
配置培养基、（调PH、分装）、灭菌、倒平板、接种和分离、培养等步骤
03
1、制备培养基
配制培养基
灭菌
倒平板
倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。具体操作步骤如下。
1.拔出锥形瓶的棉塞。
2.将瓶口迅速通过火焰。
3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
不要完全打开，以免杂菌污染培养基
低于44 ℃会凝固，温度太高会烫手
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
1、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
①可以防止皿盖上的水珠落入培养基，
②可以避免培养基中的水分过快蒸发。
问题思考与分析：
问
1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
2.将制备的空白平板，置于恒温培养箱中培养一段时间，平板上长出了菌落，可能的原因是？
培养基灭菌不彻底或接种过程中受到杂菌污染
第二步：接种和分离酵母菌
1.方法：平板划线法
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面
平板划线的具体操作步骤
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞。
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液。
⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。
⑥左手在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
酵母菌的纯培养
以免接种环温度太高，杀死菌种。
随着划线次数的增加而菌种的数量逐步减少
杀死接种环原有微生物，以免污染培养基。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染.
3、酵母菌培养
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-48h。
用记号笔标记培养皿中菌落皿底上
平板划线法可以对菌种进行分离，不能对培养液中菌种进行计数
细菌：37 ℃
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水；离开实验室时一定要洗手，以
防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免
污染环境。
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前对接种环进行灼烧灭菌
④划线后,培养皿倒置培养。划线操作结束后，仍需灼烧接种环
平板划线法注意事项:
第4区划线
平板划线法
如图所示，接种环共需灼烧几次？
6次
灼烧时期 目的
①取菌种前
②每次划线前
③接种结束后
杀死接种环上原有微生物，以免污染培养基。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端。从而通过划线次数的增加，每次划线时菌种的数量逐渐减少，以便得到单个菌落。
杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
灼烧接种环的目的:
纯培养：
获得由单一个体繁殖所得的微生物群体(单菌落)的过程。
微生物群
稀释分散
单个细胞
繁殖
单菌落
土壤微生物的纯培养
原理：
方法：
稀释涂布平板法:
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
(1)样品梯度稀释：
2.土壤微生物纯培养的操作过程：
将10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的是试管中，依次等比稀释。
90mL无菌水
101
10g土样
(2)取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
(1)将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
(3)将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
（2）涂布平板操作：
一浸二滴三灼四涂
1×107
涂3个平板（重复实验）1个不涂（空白对照）
（3）.培养：
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的温度下培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
38
40
42
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
统计依据
用稀释涂布平板法可以推测出土壤微生物中活菌的数量吗？
38
40
42
思考1、1g土的体积约为 ________ ml,10g菟加入到90ml无菌水，相当于稀释了______ 倍。
思考2、假如104 稀释度下涂布的3个平板的菌落数分别为42、40、38，则1ml稀释液中的菌株数为 __________ ，104 稀释度的试管中的菌株数为 ________ ，102 稀释度的试管中的菌株数为 ________ ，101 稀释度的锥形瓶中的菌株数为 _________ 。101 稀释度的试管中的菌株来自于10g土，所以1g土中的菌株数为 _________。
1
10
400
4×103
4×105
4×107
4×106
38
40
42
计算公式：
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
每克样品（1g土或1ml原始菌液）中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
公式进行计算
微生物的数量测定
注意事项：
1.为了保证结果准确，每个稀释度，一般设置3个平板，选择30-300个菌落的平板进行计数，并取平均值。
2.统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 菌落。因此，统计结果一般用 而不是用活菌数来表示。
少
一个
菌落数
3.设置对照：主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度
平板上统计结果数一般用 表示（“菌落数”或者“活菌数”），一般选择数目在范围的平板上计数。若甲、乙研究员同时做这个实验，甲统计的菌落数分别是90、178、259、390；乙统计的菌落数分别是125、132、135、128，则每克土壤中含有的固氮菌为 个，运用这种方法统计的结果往往较实际值 ，
原因是
菌落数
1.3×10 7
小
当两个或多个细胞连在一起时，只能观察计数为一个菌落
显微镜直接计数法
①原理：
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
统计结果一般活菌数和死菌的总和，故统计的结果比实际值偏大。
注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。
（“染色排除法”）
先将盖玻片放在血细胞计数板的计数室上
稍待片刻，待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部，计数板移至载物台的中央
计数一个小方格内的酵母菌数量，估算试管中的酵母菌总数
用吸管吸取培养液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入。多余培养液用滤纸吸去。
抽样检测法——步骤
盖玻片
血细胞计数板由一块厚玻璃特制而成，其中央有计数室。计数室分为9个大方格，每个大方格的面积为1 ，加盖玻片后的菌液深度为0.1㎜.因此每个大方格的体积为0.1
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
一个大方格的容积:0.1 =10 -4 毫升
对稀释涂布平板法和显微镜直接计数法进行比较
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、_____________ 　　　　　　 等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的　 　数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
血细胞计数板
或细菌计数板
菌落
1.两种纯化方法的比较
核心归纳
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
能否用 于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
评估论点的可信程度
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
一、概念检测
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用（P14）
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
练习与应用（P14）
(1) 这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有______________。
培养皿和培养基
(2) “将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
接种
（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用
什么方法来避免手上微生物的污染？
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？
二、拓展应用
意味着培养液中02含量不同。
练习与应用（P14）
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是
什么
培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌
的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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