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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
传统发酵通常直接利用原材料中天然酵母菌
工业生产通常使用人工选育的高活性酿酒酵母
如何获得纯种酵母菌？
03 微生物的纯培养
1.相关概念
2.微生物纯培养的步骤
(1)培养物：
(2)纯培养物：
(3)纯培养：
获得 的过程。
①配制培养基
②灭菌
③接种
④分离
⑤培养等
三、微生物的纯培养
在微生物学中，将接种于 内，在合适条件下形成的含 的群体。
由 所获得的微生物群体。
纯培养物
培养基
特定种类微生物
单一个体繁殖
课本P11
(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(2)单菌落：一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
（3）特征：
（4）功能：
(4)获得单菌落的方法：
1.实验原理
酵母菌的纯培养
探究 实践
将单个微生物分散在固体培养基上的方法
①稀释涂布平板法、②平板划线法。
大小、形状、隆起程度、颜色等。
鉴定菌种的重要依据
微生物群
分散或稀释
单个细胞
繁殖
单菌落
课本P12
03
酵母菌的纯培养
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
灭菌
倒平板
配制培养基
制备培养基
四、方法步骤
课本P12
（1）配制培养基
配制培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
四、方法步骤
课本P12
（2）灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa 、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃ 灭菌2h。
四、方法步骤
课本P12
03 微生物的纯培养
(3)方法步骤：
—③倒平板
注意
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
防止瓶口微生物污染培养基
既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，又可以避免培养基中的水分过快挥发。
温度过高容易烫伤，低于50℃琼脂会凝固。
避免杂菌污染。
课本P12
平板划线法
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
连续划线法
分区划线法
课本P13
三、微生物的纯培养
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞.
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次划线相连。
平板划线法
课本P13
目的：杀死接种环上原有微生物
⑦杀死上次划线接种环上残留的菌种，使下一次划线时菌种来源于末端
三、微生物的纯培养
第1次划线
灼烧接种环灭菌
第2次划线
灼烧接种环灭菌
第3次划线
灼烧接种环灭菌
灼烧接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③每次划线前灼烧接种环进行灭菌；
④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，培养皿倒置培养。
分区划线法
平板划线法
接种环共需灼烧几次？
6次
课本P13
目的：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
3.在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
4.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
5.在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
6.为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
将聚集的菌体逐步稀释，以便获得单个菌落。
1.为什么在操作的第一步要灼烧接种环？
2.为什么从第二次划线开始，每次划线之前都要灼烧接种环？
杀死接种环上可能存在的微生物
避免残留的菌种污染环境和操作者
如果最后一次划线和第一次划线相连，则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。
取菌种前
杀死上次划线接种环上残留的菌种，使下一次划线时菌种来源于末端
平板划线法常考问答
划线前
接种结束后
03 微生物的纯培养
(3)方法步骤：
—⑤培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。
设置未接种平板组的意义是什么？
作对照，以确定所倒平板是否被杂菌污染或灭菌是否彻底。
03 微生物的纯培养
(4)结果分析与评价：
未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染或灭菌不彻底；若无，则说明培养基未被污染且已彻底灭菌，培养基可以使用
你是如何记录实验结果的？
提示（可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等）
在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
（2）在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
课本P13
巩固练习
下列接种过程正确的顺序是？
b a e f c g d
练习册P15
练习册P15
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
评估论点的可信程度
思维训练
①水果“酵素”是什么？
②其制作原理是什么？
③其中可能含有哪些成分？
④其是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？
⑤其中的所有成分都有益于人体健康吗？
④不存在它独有的、特殊的营养物质。
课本P14
①“酶”的另一种说法。
②原理：利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。
③可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分。
⑤其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制——降低食品的水分含量；
腌制——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
课后练习题
课本P14
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
课后练习题
课本P14
2. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
这时候已经达到了环境容纳量。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
课后练习题
课本P14
微生物的基本培养技术
无菌技术
煮沸消毒法
纯培养
培养基
固体培养基
接种分离
平板划线法
稀释涂布平板法
种类
液体培养基
营养
水、碳源、氮源、无机盐
消毒
巴氏消毒法
灭菌
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
化学消毒法
紫外线消毒法
课堂小结
核心归纳
1. 培养基的种类：按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。
2. 培养基的基本化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源等。培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
3.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
4.培养基灭菌常采用湿热灭菌法，培养皿灭菌常采用干热灭菌法，接种环和涂布器灭菌常采用灼烧灭菌法。
核心归纳
5.微生物的纯培养是获得纯培养物的过程
6.微生物的纯培养过程包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养。
7.一个菌落就是一个种群。
8.平板划线操作的第一步是灼烧接种环，目的是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述,错误的是 (　　)
A.用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌,指示剂不变红
B.分解尿素的细菌能产生脲酶,将尿素分解产生NH3和CO2
C.统计尿素分解菌的数目时,以菌落数为30~300的平板进行计数
D.将实验组和对照组平板倒置,30~37 ℃恒温培养1~2天
A
4.下图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程,下列叙述错误的是 (　　)
A.能产生脲酶的细菌可以分解利用尿素
B.图中逐级稀释的程度会直接影响细菌培养基上的菌落数量
C.培养基中可添加KH2PO4、Na2HPO4以提供无机盐和作为缓冲剂
D.培养基①应以尿素为唯一氮源,培养基②的作用是纯化培养产脲酶细菌
D
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合
物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
练习与应用（P20）
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌,请你给出详细的实验方案。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
透明圈直径与菌落直径比值越大，
说明分解纤维素的能力越强
【练习】9.土壤是微生物的天然培养基,下面是有关土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的实验过程,请根据下图回答相关问题。
(1)为分离出土壤中分解尿素的细菌,应该用　　　　　　　　的选择培养基进行分离。 (2)若取土样5 g,应加入　　　　 中配制成1×101倍稀释的土壤溶液。因土壤中细菌密度很大,需要不断加以稀释,配制成如上图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前,一定要　　　　　　　　以减少误差。从1×103-1×107倍稀释的稀释液中分别吸取0.1 mL加到固体培养基上,用　　 将其分散,每个浓度稀释液至少接种　　个平板,以减少实验误差。 (3)将接种的培养皿　　　　在30-37℃的　　　 箱中培养1-2 d,观察并统计　 ,结果如上表所示。找出合适浓度,推测出每克土样中的菌落数为　 。
稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107
平均菌落数 >500 367 248 26 18
以尿素为唯一氮源
45 mL无菌水
摇匀(振荡、混匀)　
涂布器
3
倒置
恒温培养　
菌落数
2.48×108
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红-亚甲蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽)
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
拓展延伸
比较选择培养基与鉴别培养基
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
提示：如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
提示：如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计

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