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(共42张PPT)
2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交技术可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？　　　　　
温故而知新：
动物细胞融合技术
植物体细胞杂交技术的优势：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。　　　　
实例1：自然条件
受精作用
1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验
实例2：人工诱导
细胞膜具有流动性
一、动物细胞融合技术
1.概念：
2.结果：
动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
形成的具有原来 的 细胞，称为 。
单核
两个或多个细胞遗传信息
杂交细胞
3.原理：
细胞膜的流动性
一、动物细胞融合技术
4.动物细胞融合的方法：
与植物原生质体融合的方法相同
物理方法：
动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。
电融合法、离心法
化学方法：
聚乙二醇（PEG）法
生物方法：
灭活病毒诱导法
——动物细胞融合特有
一、动物细胞融合技术
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
肺结核病人病理切片
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
灭活病毒诱导法
一、动物细胞融合技术
病毒的灭活
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（诱导细胞融合）
灭活病毒诱导细胞融合的原理
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合完成的标志？
细胞核的融合
一、动物细胞融合技术
5.构建动物细胞融合模型：
①融合过程:细胞膜融合→细胞质融合→ ________融合。
②重组细胞的特点: 具有____________________,杂种细胞表现出两个_________的特点。
③融合后的杂交细胞经过__________后仍能形成两个完整的杂交细胞。
动物细胞A
动物细胞B
膜融合、质融合
动物细胞培养
杂交细胞（单核）
物理、化学、生物法诱导
细胞核
亲本细胞
有丝分裂
两种细胞的遗传信息
一、动物细胞融合技术
6. 意义：
7. 应用：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。
一、动物细胞融合技术
动物细胞融合与受精作用的区别
（1）受精作用：是在同种生物之间进行的，精子与卵细胞的融合不需要任何诱导剂，受精卵内具备同种生物的两个亲本的遗传物质。
（2）动物细胞融合可在不同物种间进行，由于物种间存在生殖隔离，所以自然条件下不能融合成杂交细胞，必须有诱导剂才能融合。形成的杂交细胞具备两个亲本细胞的遗传物质，从而体现两个亲本的遗传特性。
一、动物细胞融合技术
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、
植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、离心法；高Ca2+-高pH融合法
聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、
灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
总结：比较植物体细胞杂交和动物细胞融合
1、下列关于动物细胞融合的说法,错误的是
A.动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程
B.动物细胞融合需要用纤维素酶处理
C.动物细胞融合时需人工诱导
D.常用的诱导动物细胞融合的因素有:聚乙二醇、灭活的病毒等
2、如图为细胞融合的示意图,下列叙述正确的是
A.若a细胞和b细胞是植物细胞,需先去分化再诱导融合
B.a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现
C.c细胞的形成与a、b细胞膜的流动性无关
D.c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因
练习
B
B
3、下列关于动物细胞融合与植物体细胞杂交技术的说法正确的是
A.基本原理相同
B.诱导细胞融合的方法相同
C.细胞融合前的处理过程相同
D.融合后都需要进行筛选
D
练习
1.抗体
是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
抗体如何识别抗原？
2.体液免疫流程
二、单克隆抗体及其应用
抗原不纯
抗体不纯
产量低、纯度低，
且抗体的特异性差、灵敏度低。
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
3、早期获得抗体的方法
抗原
免疫过程
传统抗体
多种混合
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
缺点
血清抗体
二、单克隆抗体及其应用
动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。
遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。在体外培养条件下，如何让一个B淋巴细胞无限增殖？
一个B淋巴细胞
B淋巴细胞群
单克隆抗体
克隆
产生
二、单克隆抗体及其应用
为什么B淋巴细胞能不能无限增殖？
单个B淋巴细胞寿命有限，又因为能产生抗体的B淋巴细胞属于高度分化的细胞，不可能无限增殖。
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案。
解决
米尔斯坦
【英国】
科勒
【德国】
发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
二、单克隆抗体及其应用
基本思路
一种B淋巴细胞
（只产生一种特定抗体）
能在体外大量增殖的
骨髓瘤细胞
融合
杂交瘤细胞
产生足够数量的特定抗体
大量
增殖
单克隆抗体
单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
二、单克隆抗体及其应用
用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
多种杂交细胞
BB 、B瘤 、瘤瘤
不是为了得到抗体！
√
二、单克隆抗体及其应用
杂交瘤细胞
(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
多种杂交细胞
用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
在培养液中加入氨基嘌呤，收集杂交瘤细胞！
小资料：正常细胞合成DNA有D和S两条途径，
其中D途径能被氨基嘌呤阻断。
①人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。
②鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。
二、单克隆抗体及其应用
培养基中加入氨基嘌呤
细胞无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去。
将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为：
B细胞和B-B细胞________________________________________
骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞_____________________________________________
杂交瘤细胞________________________________________________
死亡；能进行补救合成途径，但是无增殖能力；
死亡；两种途径均无法进行，无法合成DNA，无法增殖；
存活；能进行补救合成途径，能合成DNA，可大量增殖；
思考：得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？
杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选；
二、单克隆抗体及其应用
D途径
S途径
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞
分泌的抗体能与特定抗原结合
二、单克隆抗体及其应用
将杂交瘤细胞群稀释，
约每孔1个进行培养（克隆化培养）
一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）
经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，
就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）
AB1、AB2、AB3 ……
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
★
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
二、单克隆抗体及其应用
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔内
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
单克隆抗体
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
细胞培养液提取
小鼠腹水中提取
二、单克隆抗体及其应用
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
二、单克隆抗体及其应用
不同水平的克隆及实例
（1）分子水平的克隆：如DNA复制、PCR技术。
（2）细胞水平的克隆：如细胞增殖、动物细胞培养。
（3）个体水平的克隆：如植物组织培养、动物细胞核移植。
二、单克隆抗体及其应用
练习
4、下列关于细胞工程的叙述，错误的是
A.电融合法可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合
B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理
C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫的小鼠B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体
D.培养人的浆细胞能产生单克隆抗体
5、单克隆抗体制备过程中使用的骨髓瘤细胞是一种缺陷型细胞，在含有次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶的培养基(HAT)中无法生长；而小鼠B淋巴细胞是正常细胞，在HAT培养基上可正常存活。用聚乙二醇诱导细胞融合后，经过数代培养，最终可在HAT培养基上存活的细胞是
A.骨髓瘤细胞之间形成的融合细胞
B.B淋巴细胞间形成的融合细胞
C.骨髓瘤细胞与B淋巴细胞之间形成的融合细胞
D.B淋巴细胞
D
C
6、下列是应用动物细胞工程技术获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤,选项中对单克隆抗体制备的相关叙述不正确的是
①将X抗原注入小鼠体内,获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞　
②从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞　
③利用促细胞融合因子使两种细胞发生融合　
④将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔培养　
⑤筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞　
⑥从腹水中提取抗体
A.实验顺序应当是①②③⑤④⑥
B.④过程中产生的多个杂交瘤细胞也称为克隆
C.③过程获得的细胞均可无限增殖
D.③到⑤的过程中通常要经过两次筛选
C
练习
7、(不定项)对于如图所示制备单克隆抗体过程示意图,正确的叙述是
A.①表示B淋巴细胞和骨髓瘤细胞均是从小鼠的脾脏中提取的
B.④中的筛选是通过抗原—抗体反应进行的
C.②促进细胞融合的方法可以利用聚乙二醇作诱导剂
D.⑤可以无限增殖
BCD
练习
8、(2020全国)为研制抗病毒
A的单克隆抗体,某同学以小鼠
甲为实验材料设计了以下实验
流程。
回答下列问题:
(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A,该处理的目的是_______________
______________________________________。
(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤:_________
_____________________________。
(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于_______________,使用该培养基进行细胞培养的结果是______________ ____。图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是__________________________。
(4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,可采用的方法有____________________________________ ________(答出2点即可)。
诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞
取小鼠甲脾脏剪碎,用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞,加入培养液制成单细胞悬液
选择培养基
只有杂交瘤细胞能够生存
抗原与抗体的反应具有特异性
将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖;将杂交瘤细胞在体外培养
练习
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
女性怀孕后会分泌一种糖蛋白
——人绒毛膜促性腺激素（HCG），尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。
①作为诊断试剂(最广泛的用途)
思考·讨论
？
准确、高效、简易、快速
单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
二、单克隆抗体及其应用
资料2: 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物(ADC)，将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
单克隆抗体的应用
ADC的作用机制示意图
①
ADC
②
③
④
溶酶体裂解
释放药物
⑤
细胞凋亡
ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成
二、单克隆抗体及其应用
思考·讨论
？
②用于疾病的治疗和运载药物 (主要用于癌症的治疗)
单克隆抗体：
(1)特异性强、灵敏度高
生物导弹
单抗
抗癌药物
★ 原理：
(2)疗效高、毒副作用小 ：
不损伤正常细胞，减少剂量
导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置
抗癌药物：
杀死癌细胞
单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
思考·讨论
？
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞； 药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。
一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。
ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
思考·讨论
？
4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。
单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
思考·讨论
？
9、由单克隆抗体研制而成的“生物导弹”由两部分组成,一是“瞄准装置”,二是杀伤性“弹头”,下列对此描述不正确的是
A.“瞄准装置”由识别癌细胞的单克隆抗体构成
B.“弹头”由放射性同位素、化学药物或细胞毒素等物质构成
C.“弹头”中的药物有选择性杀伤癌细胞的功能
D.“生物导弹”是利用细胞工程制造出来的
10、下列关于单克隆抗体的叙述,不正确的是
A.可以制成诊断盒,用于疾病的诊断
B.可以与药物结合,用于病变细胞的定向治疗
C.可以利用细胞工程技术生产
D.可以在生物体内生产,不能在体外生产
C
D
练习
11、如图是抗HCG(人绒毛膜促性腺激素)单克隆抗体制备流程图,相关叙述正确的是
A.①过程中促融剂常用聚乙二醇,不可用灭活的病毒
B.②过程中筛选出的杂交瘤细胞都能产生抗HCG抗体
C.③过程中利用了DNA分子杂交的原理
D.④过程中培养液中需要添加动物血清、抗生素等物质
D
练习
课堂小结
概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是
A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题 解决这些问题的大致思路是怎样的 这样做会有什么风险 请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。
但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。

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