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(共45张PPT)
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
——微生物的选择培养
和计数
发酵工程
目录 /CONTENTS
01
02
03
选择培养基
微生物的选择培养
微生物的数量测定
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生 物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
那么我们又如何达成这一目标呢？
资料：1973年，科学家在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）。
讨论：
1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
问题探讨
（P16）
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而水生栖热菌能在70-800C高温条件下生存。
资料：1973年，科学家在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）。
讨论：
问题探讨
2. 当我们也要自然界中筛选一种特定的微生物时,结合以上资料我们应该遵循什么筛选的原则呢？
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2. 筛选原则
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
你还知道哪些条件能影响微生物的生存？
pH和氧气浓度等
资料：1973年，科学家在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）。
讨论：
问题探讨
3.这对在实验室中选择培养（筛选）特定的微生物有什么启示？
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（P16）
选择培养基
1
选择培养基
01选择培养基1.概念:2.类型:在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源水生栖热菌酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自养型微生物固氮菌01选择培养基尿素的立体结构【思考·讨论】尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。CO(NH2)2脲酶+ H2O+ CO22NH301选择培养基【思考·讨论】在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml选择培养基思考：该选择培养基就一定起到选择作用吗？如何证明选择培养基具有选择作用呢？01选择培养基【思考·讨论】牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二完全培养基选择培养基思考：该选择培养基就一定起到选择作用吗？如何证明选择培养基具有选择作用呢？以完全培养基为对照，进行与选择培养基同样的实验操作过程，来证明选择培养基的选择作用。若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。01选择培养基2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？【思考·讨论】除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。思考：仅通过选择培养基可以知道1g土塘中有多少能分解尿素的细菌吗？1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
　不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
2
微生物的选择培养
02
微生物的选择培养
任务：阅读P17-18，回答问题：
(1). 稀释涂布平板法的定义。
(2).实验过程用箭头画流程图。
(3).实验过程需要设置对照组吗？
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素的细菌
(1)、稀释涂布平板法的定义 P17
02
微生物的选择培养
1.分离分解尿素的细菌
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素的细菌
02
微生物的选择培养
(2)、实验的具体操作：
制备培养基
土壤取样
样品梯度稀释
取样涂布平板
培养与观察
几种
2种
选择培养基
完全培养基
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素的细菌
牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml完全培养基(2).步骤：02微生物的选择培养选择培养基制备培养基配置培养基灭菌倒平板（一）稀释涂布平板法1.分离分解尿素的细菌 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。 P19
①土壤取样
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
(2).步骤：
（1）梯度稀释菌液
02
微生物的选择培养
土样需要灭菌吗？
土样中含有目的菌，不能灭菌。
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素的细菌
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
②样品的稀释
2.步骤：
（1）梯度稀释菌液
02
微生物的选择培养
稀释10倍
依次稀释10倍
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素的细菌
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
微量移液器
(2)稀释涂布平板法操作
(2).步骤：
02
微生物的选择培养
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素
的细菌
02
微生物的选择培养
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素的细菌
稀释涂布平板法操作的注意事项：
⑴各操作细节要保证“无菌”，所有操作都应在酒精灯火焰旁进行。
⑵将涂布器浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
（3）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
待涂布的菌液被培养基吸收
将平板倒置
30～37℃恒温培养1～2d后进行计数
2.步骤：
（3）菌落培养
02
微生物的选择培养
（一）稀释涂布平板法
1.分离分解尿素的细菌
分析：需要设置对照组吗？
按照以下的实验目的说说如何设置对照组？
①选择培养基是否起到了筛选的作用（筛出一些菌落）？
②分析培养物中是否有杂菌污染？
对照组：接种的普通（牛肉膏蛋白胨）培养基
实验组：接种的以尿素为唯一氮源的培养基
对照组：未接种的以尿素为唯一氮源的培养基
实验组：接种的以尿素为唯一氮源的培养基
接种的普通（牛肉膏蛋白胨）培养基
未接种的普通（牛肉膏蛋白胨）培养基
对照组设置
接种牛肉膏蛋白胨的培养基：判断选择培养基是否起
作用
未接种的牛肉膏蛋白胨培养基：判断牛肉膏蛋白胨培养
基是否被污染
未接种的选择培养基：判断选择培养基是否被污染
1.得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步鉴定
2.如何设计实验对其进行鉴定呢？
提示：
呈 性，PH ；
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
遇 呈 色
红
碱
酚红指示剂
升高
你想到了吗？
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
再探
3
微生物的数量测定
03微生物的数量测定任务：阅读P18，回答问题：(1).稀释涂布平板法为什么可以用于细菌的计数？(2).通过稀释涂布平板法统计的细菌数目与它的实际数目相同吗？(3).为了保证计数结果的准确，计数操作中需要遵循那些计数原则？(4).尝试列表比较平板划线法和稀释涂布平板法的异同点。03微生物的数量测定任务：阅读P18，回答问题：(1).稀释涂布平板法为什么可以用于细菌的计数？当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。03微生物的数量测定任务：阅读P18，回答问题：(2).通过稀释涂布平板法统计的细菌数目与它的实际数目相同吗？因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。03微生物的数量测定任务：阅读P18，回答问题：(3).为了保证计数结果的准确，计数操作中需要遵循那些计数原则？1.为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数；2.每个稀释度至少取3个平板取其平均值；03微生物的数量测定任务：阅读P18，回答问题：(3).为了保证计数结果的准确，计数操作中需要遵循那些计数原则？1.为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数；如何找到适合计数的平板？1.在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品进行培养，例如测定土壤中细菌的数量，一般选用一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。例如将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养03微生物的数量测定任务：阅读P18，回答问题：(3).为了保证计数结果的准确，计数操作中需要遵循那些计数原则？2.每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。1.为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数；如何找到适合计数的平板？防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。03微生物的数量测定任务：阅读P18，回答问题：(3).为了保证计数结果的准确，计数操作中需要遵循那些计数原则？2.每个稀释度至少取3个平板取其平均值；这样操作的目的是什么？遵行的什么实验原则？排出实验中偶然因素对实验结果造成的影响。平行重复实验的原则。 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作
接种工具
菌体获取
优点
缺点
接种环在固体平板培养基
表面连续划线
接种环
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
操作简单，可以根据菌落的特点
获得某种微生物的单细胞菌落
不能对微生物计数
①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
既可以获得单细胞菌落，
又能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
涂布器
共同点
都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征。
(4). 尝试列表比较平板划线法和稀释涂布平板法的异同点。
1
稀释涂布平板计数法
（3）统计菌体数目计算公式：
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
03
微生物的数量测定
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
每g样品中的菌落数＝ 9×107个
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释
倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。P19
实例分析：
实例分析：
3.
思考：还有其他的计数方法吗？
血细胞计数板：
细菌计数板：
缺点：
①不能区分死菌和活菌→偏大
②不适于对运动细菌的计数。
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
优点：快速、直观
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
方法2：显微镜直接计数法
直接计数法
（“染色排除法”）
03
微生物的数量测定
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
03
微生物的数量测定
换算为一个大方格（0.lmm ）稀释液中的菌株数
显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、血细胞计数板 培养基
计数依据 菌株本身 培养基上的菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌活菌都计算在内 操作复杂，有一定误差
计算公式 1ml原液含菌株数=每小格平均菌株数*400*10*1000*稀释倍数 lml原液含菌株数=平均菌落数/涂布平板所用稀释液体积（（ml） x稀释倍数
总结：直接计数与稀释涂布平板法的比较
换算 1mm3稀释液中的菌株数
换算 1ml稀释液中的菌株数
换算 1ml原液中的菌株数
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
总结
样品稀释涂布平板
微生物的培养与观察
菌落计数
土壤取样
制备培养基
四、实验流程：
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合
物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
二、拓展应用
一、概念检测
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ）
√
√
√
练习与应用
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( )
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
二、拓展应用
1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。
①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养
②创造无氧环境进行培养
练习与应用

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