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(共22张PPT)
第3章 基因工程
3.2 基因工程的基本操作程序 第1课时
—目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
1
2
简述PCR的原理、条件及过程
简述基因表达载体的组成及构建过程
学习目标
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
培育转基因抗虫棉
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
核 心
一、目的基因的筛选与获取
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
导入
抗虫棉
培育
棉花细胞
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。
主要是编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子
1
目的基因
一、目的基因的筛选与获取
科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解
利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
2
筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因
一、目的基因的筛选与获取
①通过构建基因文库来获取目的基因
②人工合成目的基因
③利用PCR特异性地快速扩增目的基因
前提：
方法：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
3
获取目的基因的方法
一、目的基因的筛选与获取
提取
？
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
4
利用PCR获取和扩增目的基因
一、目的基因的筛选与获取—利用PCR获取和扩增目的基因
PCR技术发明者：穆里斯
4
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（1）PCR——聚合酶链式反应的概念、原理
DNA半保留复制
PCR扩增仪
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
DNA母链
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
四种脱氧核苷酸(dNTP)
（2）基本条件
一般添加Mg2+
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
模板、原料、能量、酶、引物、
缓冲溶液、不同温度
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
（3）PCR反应过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
（4）PCR的结果：
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
（5）PCR产物的鉴定：
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
变性
90℃以上
延伸
72℃左右
复性
50℃左右
基本过程
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
1.利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
第3轮；1/4。
思考
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
2．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。
第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
思考
3．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
共需消耗2n－1对引物。
二、基因表达载体的构建
2
组成
人们所需要的基因
作用：
便于重组DNA分子的筛选
位置：
功能：
基因的下游（一段特殊的DNA片段）
终止转录
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
1
目的
二、基因表达载体的构建
基因表达载体构建模式图
3
基因表达载体的构建过程
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
同一种限制酶（或能产生相同黏性末端的限制酶）处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
二、基因表达载体的构建
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
请结合下图，回答问题：
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
思考
二、基因表达载体的构建
请结合下图，回答问题：
思考
（2）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
拓展
1.原核基因的结构和表达
翻 译
转 录
mRNA
蛋白质
拓展
2.真核基因的结构和表达
加 工
转 录
mRNA前体
成熟mRNA
外显子
内含子
翻 译
蛋白质
课堂小结

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