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第四章 基因工程
第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性
第一课时
稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40%～50%，甚至颗粒无收。严重影响到粮食安全。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因水稻，它可以有效抵御稻瘟病菌的感染。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，你认为科学家需要用到哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因水稻(左）与野生型水稻(右）
1.基因工程的概念：
指有意识地把一个人们所需的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。
（1）别名：
（2）原理：
（3）操作对象：
（4）操作水平：
（5）结果：
重组DNA技术
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
一、基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来
思考1：为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
思考2：为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1）基因是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递都遵循中心法则。
（3）生物界共用一套遗传密码。
（1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
（2）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
一、基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
2、基因工程的建立过程
一、基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来
（一）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
简称：限制酶
（1）来源：
主要存在于细菌等微生物中。
（2）作用：
识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，使DNA双链在特定的位置断开。
（3）作用部位：
特定部位的磷酸二酯键
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
5’
3’
磷酸二酯键
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
不同限制酶的识别序列一般也各不相同。
5.作用结果(切割产物)
例如，发现于大肠杆菌中的限制酶EcoR Ⅰ的识别序列如图所示，两条链从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC。
DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端
（4）识别序列
识别序列通常是4～8个核苷酸对，以6个核苷酸对最为常见
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
黏性末端黏性末端实例1—EcoRⅠ限制酶：识别序列为GAATTC，切割部位为GA之间的磷酸二酯键。实例2——SmaⅠ限制酶：识别序列为CCCGGG切割部位为CG之间的磷酸二酯键。形成黏性末端平末端形成平末端二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础（6）限制酶的命名：
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
思考3：根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。
限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。所以，简单来说,限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
课堂练习：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ____ EcoRⅠ___
HindⅢ___ BglⅡ ___
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考4：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
现有5种不同的限制酶:①HindⅢ、②XbaⅠ、③EcoRⅤ、④SpeⅠ和⑤XhoⅠ,它们的识别序列和切割位点如下:
1.XhoⅠ切割DNA之后形成的末端为　　　　　　　　　　　　　。
2.切割DNA片段后可形成平末端的限制酶有　　　(填编号),可以形成黏性末端的限制酶有　　　　　　(填编号)。
3.限制酶　　　(填编号)切割某一DNA片段后产生的DNA片段能与SpeⅠ切割另一DNA片段产生的DNA片段相连接,
原因是　　　　　　　　　　　　　　　　 　。
连接后形成的重组DNA分子　　　　(填“能”或“不能”)再被原有的两种限制酶识别,原因是　　　　　　　　　。
①②④⑤
③
②
这两种限制酶切割DNA片段后形成的DNA片段的黏性末端是互补的
不能
重组后的DNA分子序列为 原来的两种限制酶均不能识别。
检测练习1：
2.分类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点 大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
（二）DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
GC T TA AA A T TCGGC T T A AA AT TCG用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础思考5： DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用实质
作用结果
模板
相同点 催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
需要
不需要
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
思考6：DNA连接酶、DNA聚合酶、限制酶、解旋酶的
作用底物、作用部位和形成产物有什么异同
种类 作用底物 作用部位 形成产物
DNA连接酶
DNA聚合酶
限制酶
解旋酶
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
DNA分子
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
重组DNA分子
新的DNA分子
含黏性末端或平末端的DNA片段
单链DNA
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
重组DNA分子
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
小组讨论：
重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
小组讨论：
思考7：用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？
4个
下面是4种限制酶所识别的DNA分子序列和剪切位点图(↓表示剪切点,切出的断面为黏性末端)。下列说法正确的是(　　)
A.在使用限制酶的同时还需要解旋酶
B.限制酶1和3剪切出的黏性末端相同
C.限制酶1、2、4识别的序列都是由4个脱氧核苷酸组成
D.限制酶1和2切割形成的DNA片段可通过T4 DNA连接酶拼接
B
检测练习2：
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用：将外源基因送入受体细胞。
2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
大肠杆菌及质粒结构模式图
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
思考8：作为载体需具备哪些条件？
（2）含有一种或多种限制酶的识别序列，方便外源DNA片段（基因）插入其中。
（1）含复制起点，能够独立自主复制并稳定存在
（3）具有筛选作用的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
最常用的运载体——质粒
（1）质粒的化学本质：
独立于细菌拟核DNA的较小的环状DNA分子
（2）基因工程中使用质粒的特点：
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过_________的；这些质粒上常有特殊的标记基因，便于__________________；
人工改造
重组DNA分子的筛选
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。
①或②
①
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
检测练习3：
（3）种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
1.实验原理：
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
活动探究：DNA的粗提取与鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
思考9：能不能选择猪血？
二、材料用具
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
活动探究：DNA的粗提取与鉴定
不能，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
三、方法步骤
称取10 g香蕉果肉，放入研钵中，倒入10mL_______充分研磨
研磨
过滤
在漏斗中垫上_________，将研磨液过滤入离心管中
取两支试管，一支试管中加入提取出的白色絮状物，并加入2mL二苯胺剂；另一支只加入2mL二苯胺剂。用95 ℃水浴锅加热10 min，注意观察两支试管中溶液颜色的变化
离心
以3000 r/min的转速离心2 min，取________倒入小烧杯中
向小烧杯中倒入体积是上清液两倍的_______静置3-5 min，可见白色的絮状物出现。用_______缓缓搅动，絮状物会缠在玻璃棒上
鉴定
加冷酒精
研磨液
尼龙纱布
上清液
冷酒精
玻璃棒
活动探究：DNA的粗提取与鉴定
思考10：研磨的目的是什么？
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
思考11：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
活动探究：DNA的粗提取与鉴定
思考12：搅拌时应轻缓、并沿一个方向原因是什么？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
思考13：若提取出的不是白色丝状物，说明什么？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
思考14：二苯胺试剂鉴定如果未呈现蓝色说明什么？
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。

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