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第二章 细胞工程
克隆技术
细胞工程
细胞工程
植物组织培养技术
细胞工程是指应用_______________ ___________________和 的原理和方法，通过_______ _、_________ _上的操作，有目的的获得特定的___ __的一门综合性生物工程。
什么叫细胞工程？
按操作对象分
植物细胞工程
动物细胞工程
原理方法
研究目的
细胞生物学
分子生物学
细胞或组织水平
细胞器水平
细胞、组织、器官、个体或其产品
发育生物学
研究水平
原理和方法
操作水平
目的
分类
细胞生物学、分子生物学和发育生物学等
细胞器、细胞或组织水平
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品
植物细胞工程和动物细胞工程
细胞工程：
指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
2.1 植物细胞工程
§2.1.1植物细胞工程的基本技术
§2.1.2植物细胞工程的应用
植物组织培养
植物体细胞杂交
§2.1.1植物细胞工程的基本技术
叶子
花瓣
花粉
细胞
植物体
植物细胞工程 的基本技术
植物组织培养
植物体细胞杂交
理论基础是什么?
植物细胞的全能性
一、植物细胞工程的理论基础--细胞的全能性
1.全能性定义：
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
2.全能性的原因：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。
3.体现全能性的标志：
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
实例：胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
受精卵发育成个体（动植物）
蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰
用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株
叶原基
芽原基
叶原基只能发育成叶
芽原基只能发育成芽
这能体现细胞的全能性吗？
基因在特定时间、空间条件下选择性表达
一、植物细胞工程的理论基础--细胞的全能性
4.全能性大小的比较：
①受精卵>胚胎干细胞>生殖细胞>体细胞；
②植物细胞>动物细胞。
思考：
1.是不是所有的活细胞都具有全能性？
2.种子发育成植株体现了全能性了吗？
3.细胞具有的全能性一定能表现出来吗？
不是；
例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。
没有；
植物种子种的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，没有体现出细胞具有发育成完整植株的潜能。
不一定；
例如动物的体细胞。
（1）离体状态
（2）无菌操作
（3）种类齐全、比例适合的营养物质
（4）植物激素（主要是生长素和细胞分裂素）诱导和调节
（5）适宜的外界条件（温度、pH、光照等）
5、细胞表现全能性的条件（植物）
1 选取多肉上健康、饱满的叶片。
2 用剪刀切下整片叶片，切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。
3 平躺放在沙床上，叶片间隔相聚2~3厘米。
4 叶片切口不要有碰脏，摆放通风处2~3天，晾干。
5 待叶片晾干后移至半阴处养护。
6 约2~3周后生根，或从叶基处长出不定芽。
7 叶插成功
全能性举例---多肉进行叶插繁殖
植物的叶肉细胞能发育成植株吗？需要具备哪些条件？
二、植物组织培养技术
二、植物组织培养技术
1、概念
指离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其分化为完整植株的技术。
2、原理：植物细胞的全能性
二、植物组织培养技术
3、过程
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽或胚状体
生长发育
植物体
移栽成活
1
2
3
4
5
再分化
(愈伤组织)
植物组织培养
6
脱分化
1.什么是外植体？
2.什么是脱分化？
3.什么是愈伤组织？
4.什么是再分化？
离体的植物器官、组织或细胞
在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变为未分化的细胞，进而形成愈伤组织的过程。
未分化的细胞，脱分化形成的不定形的薄壁组织团块
愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程。
愈伤组织
阅读教材P35第二段及“探究实践”，回答下列问题。
二.植物组织培养技术
愈伤组织的特点：细胞排列疏松无规则、高度液泡化、色浅，具有较强的分裂能力
二、植物组织培养技术
3、过程
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽或胚状体
生长发育
植物体
1）外植体:离体的植物器官、组织、细胞。
如：植物的茎尖、幼嫩的叶片、花药等
外植体切段
2）脱分化：
在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变为未分化的细胞，进而形成愈伤组织的过程。
实质是恢复细胞的全能性过程。
结果是形成愈伤组织。
注意：避光、植物激素（细胞分裂素和生长素）
3、过程
为什么脱分化，诱导愈伤组织的过程中要避光培养？
在有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
离体的器官、组织或细胞，如果不进行脱分化处理能否培养成完整的植物体？
不能，因为细胞已经分化，失去了分裂能力。不进行脱分化处理就不能形成愈伤组织
3）愈伤组织：（特点）
离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种
a高度液泡化、
b无定形状态薄壁细胞组成的
c排列疏松无规则的组织。
具分裂、分化能力，既具全能性。无叶绿体,不进行光合作用
4）再分化：
愈伤组织重新分化根或芽等器官的过程。
注意：需光照、激素（生长素和细胞分裂素）
（再分化时需要光，光能使细胞内形成叶绿体、叶绿素，进行光合作用）
实质：基因的选择性表达
{BC89EF96-8CEA-46FF-86C4-4CE0E7609802}
脱分化
再分化
过程
结果
需要条件
外植体→愈伤组织
愈伤组织→幼苗
形成根、芽
形成愈伤组织
a.离体
b.适宜的营养
c.生长素与细胞分裂素的比例适中
d.一般不需光
a.离体
b.适宜的营养
c.生长素与细胞分裂素的比例高或低诱导生根或生芽
d.光照
决定植物脱分化、再分化的关键因素是什么？
植物激素的种类和比例（细胞分裂素和生长素）
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}生长素/细胞分裂素
结果
比值高(＞1)
比值低(＜1)
比值适中(≈1)
促进根的分化，
促进芽的分化，
促进愈伤组织的形成
生长素类作用：用于诱导细胞的伸长生长和根的分化
细胞分裂素类作用：促进组织细胞的分裂或从愈伤组织和器官上分化出不定芽。
拓展：植物组织培养的两种途径
胚状体途径
器官发生途径
胚状体：
离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
4、实例：菊花的组织培养
二、植物的组织培养技术
菊花的组织培养
1.了解植物组织培养的基本原理。
2.了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量的比例对菊
花愈伤组织形成和分化的影响。
3.尝试进行植物组织培养。
实验原理
植物细胞的全能性
实验目的
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽或胚状体
生长发育
植物体
（1）外植体：幼嫩的菊花茎段。
（2）体积分数为70%的酒精：对手、超净工作台、外植体进行消毒。
（3）质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液：对外植体进行消毒。
（4）无菌水：清洗外植体。
（5）MS培养基：（P116--参见本书附录1）
包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。
经常选择根尖（分生区）、茎的韧皮部（形成层）等分裂能力强、分化程度低的区域作为材料，容易诱导形成愈伤组织。
材料用具
1）培养基名称： ；
2）物理性质： ；
3）碳源： 。
拓展1：植物组织培养常用的培养基配方
P116
MS培养基
固体培养基
蔗糖（有机碳源）
蔗糖的作用：
提供能量、调节渗透压。
⑥50mL锥形瓶（或植物组织培养瓶）
植物组织培养瓶
用具：
材料用具
烧杯、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、封口箱、封口膜、滤纸、标签、消毒用酒精棉球、培养皿、解剖刀、镊子等
1.消毒
2.外植体切段
3.接种外植体
4.诱导愈伤组织
5.诱导生芽生根
6.移栽培养
消毒
外植体切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导芽和根
移栽培养
方法步骤：
1、消毒
①双手和超净工作台台面：
用酒精擦拭
②外植体:
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次。
2、外植体切段
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
注意：接种时注意外植体的方向，不要倒插！
（将“形态学上端”朝上，下端朝下）
3、接种外植体
与生长素的极性运输有关；生长素含量多的部分容易生出不定根，含量少的部分生出不定芽
4、诱导愈伤组织--脱分化
培养基及培养条件：
激素比例1：1、
置于黑暗、
提供有机碳源（蔗糖）
将接种了外植体的锥形瓶置18-22℃的培养箱中培养。
有光时往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
5、诱导生芽生根--再分化
注意：先诱导生芽，
再诱导生根！
生芽过程：诱导生芽的培养基
生根过程：诱导生根的培养基

有机营养；
无机营养。
若先生根后面就不易生芽
生长素细胞分裂素?
生长素细胞分裂素>????
?
6、移栽
打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。
流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，
长壮后再移栽入土。
幼 苗
愈伤组织
脱分化
CTK/IAA比例适合
再分化
CTK/IAA比例先增大在减小
植物组织培养过程示意图
完整植株
外植体
离体的植物器官、组织或细胞（外植体）
愈伤组织
胚状体或（根、芽）
试管苗（植物体）
脱分化
再分化
避光
光照
培养条件：
①无菌
②营养物质
③适宜环境条件（温度、PH、光等）
④植物激素：
细胞分裂素 生长素
方法步骤：
(1)在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？
防止杂菌污染，因为杂菌生长快，会和培养物争夺营养。杂菌生长过程中可能会产生有害的物质，导致培养物死亡。
合作学习
小结：
植物组织培养的过程
外植体
愈伤组织
根、芽
植物体
脱分化
再分化
（离体的,已分化组织或细胞）
（未分化）
（分化）
条件？
优点？
特点？
繁殖速度快、不受季节限制、工厂化生产、幼苗无毒、保持优良性状
①适宜温度、pH、避光、和无菌环境。
②适宜的营养和植物激素（生长素，细胞分裂素等）
无定形状态薄壁细胞、高度液泡化、排列疏松无规则，无叶绿体,不进行光合作用
条件？
①适宜温度、pH光照、和无菌环境。
②适宜的营养和植和植物激素（生长素，细胞分裂素等）
反馈练习
1.下列属于组织培养的是（ ）
A.花粉培养成单倍体植株
B.芽发育成枝条
C.根尖分生区发育成成熟区
D.未受精的卵发育成植株
A
2.在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需要的（ ）
A.消毒灭菌
B.适宜的温度
C.充足的光照
D.适宜的养料和激素
C
3.要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，不需要（ ）
A.具有完整细胞核的细胞
B.离体状态
C.导入外源基因
D.一定的营养物质和激素
C
4、植物组织培养形成的愈伤组织进行培养， 又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为：
A、脱分化 B、去分化
C、再分化 D、脱分化或去分化
5、下列不能作为植物组织培养的材料是
A、秋海棠的叶
B、马铃薯的块茎
C、成熟的花粉
D、木质部中的导管细胞
D
不能
生殖隔离，
于是，这些科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。
三、植物体细胞杂交技术
若想得到一株地上结番茄，地下长土豆的植株，用传统杂交手段能达到目的吗？
1、定义：
将不同来源的植物细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术
三、植物体细胞杂交技术
白菜
甘蓝
白菜－甘蓝
蕃茄
马铃薯
三、植物体细胞杂交技术：
番茄------马铃薯植株
1．你认为两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么？
2．有没有一种温和的去壁方法呢？
3、植物细胞去掉细胞壁后叫什么？
4．为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？(细胞融合的基础)
5、人工诱导原生质体融合的方法有哪些？
6．原生质体融合的标志是什么？
7．如何将杂种细胞培育成杂种植株？
8．植物体细胞杂交技术完成的标志是什么？
9、植物体细胞杂交的原理是什么？
请思考：
1．你认为两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么？
细胞壁，这层细胞壁阻碍着细胞间的杂交。
2．有没有一种温和的去壁方法呢？
纤维素酶和果胶酶去除细胞壁（酶解法）
3、植物细胞去掉细胞壁后叫什么？
原生质体
4．为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？(细胞融合的基础)
请思考：
细胞膜具有一定的流动性
7．如何将杂种细胞培育成杂种植株？
5、人工诱导原生质体融合的方法有哪些？
物理法
化学法
电融合法、离心法
聚乙二醇(PEG)融合法、
高Ca2+ —高pH融合法
植物组织培育技术
6．原生质体融合的标志是什么？
产生新的细胞壁
8．植物体细胞杂交技术完成的标志是什么？
获得杂种植株
9、植物体细胞杂交的原理是什么？
细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
①
①
②
③
④
⑤
⑥
植物体细胞杂交技术
融合的原生质体再生出新细胞壁
去除
细胞壁
诱导融合
细胞壁再生
脱分化
再分化
移栽
杂种植株
植物组织培养
原生质体融合
（植物细胞的全能性）
（细胞膜的流动性）
物理法：
化学法：
电融合法、离心法等
聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+ —高pH融合法等。
植物细胞融合完成的标志
植物体细胞杂交技术成功的标志
去除
细胞壁
酶解法：
纤维素酶、果胶酶
原理：
技术流程：
杂种植株
融合的原生质体AB
再生出细胞壁
脱分化
愈伤组织
再分化
2、过程
植物细胞的融合
植物组织培养
植物细胞A
原生质体B
原生质体A
杂种细胞AB
去 壁
去 壁
人
工
诱
导
方法？
促进融合的方法？
融合完成的
标志
植物细胞B
细胞融合的基础：
细胞膜的流动性
筛选
植物A细胞
植物B细胞
去壁
原生质体A
原生质体B
原生质体融合
融合体
再生壁
杂种细胞（筛选）
脱分化
愈伤组织
杂种植株
去壁方法：
酶解法（纤维素酶、果胶酶等）
融合方法：
原理：
细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
再分化
融合完成的标志：
新细胞壁的形成
物理法：电融合法、离心法
化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+ —高pH融合法
杂交技术成功的标志：
获得杂种植株
3、优势：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
4.变异类型：染色体数目变异
比较
植物组织培养
植物体细胞杂交技术
所属范畴
原理
步骤
意义
联系
无性繁殖
细胞全能性
①脱分化
②再分化
保持优良性状
繁殖速度快、大规模生产
提高经济效益
杂交技术应用了组织培养
克服不同种生物远源杂交的障碍
①去除细胞壁
②融合形成杂种细胞
③组织培养
膜流动性
细胞全能性
染色体变异、基因重组
所采用技术的理论基础
植物细胞工程
通常采用的技术手段
植物组织培养
植物体细胞杂交
植物细胞的全能性
小结：
1.为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？
生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。

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