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第3章 基因工程
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
科技探索之路：基因工程的诞生和发展
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
科技探索之路：基因工程的诞生和发展
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。大量施用农药杀虫不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，就能解决这一问题。
转基因抗虫棉
转基因抗虫棉
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种。
普通棉花
转基因抗虫棉
棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
第1节 重组DNA技术的基本工具
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
非转基因番木瓜
转基因“华农1号”番木瓜
一、基因工程的概念与理论基础
1. 概念：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
水母的绿色荧光蛋白基因
重组DNA技术、转基因技术
生物体外
基因
DNA 分子水平
基因重组
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
一、基因工程的概念与理论基础
（1）基因工程的别名：
（2）操作环境：
（3）操作对象：
（4）操作水平：
（5）基本过程：
（6）原理：
（7）结果：
（8）优点：
剪切 → 拼接 → 导入 → 表达
2. 基因工程的理论基础
（1）不同种生物的基因能拼接的理论基础
（2）外源基因在受体细胞内能表达的理论基础
①基因是控制生物性状的结构和功能单位；
②遗传信息的传递都遵循中心法则；
③生物界共用一套遗传密码（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；
②DNA分子都遵循碱基互补配对原则；
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
【回顾】中心法则
遗传信息的储存、传递、表达
复制
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
复制
蛋白质
培育转基因抗虫棉的关键步骤
关键步骤一：
抗虫基因从苏云金芽孢杆菌DNA中提取出来
关键步骤二：
抗虫基因与载体“缝合”
关键步骤三：
抗虫基因导入棉花细胞
分子缝合针
“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶
关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌DNA中提取出来
关键步骤二：抗虫基因与载体“缝合”
关键步骤三：抗虫基因导入棉花细胞
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
1. 来源：
主要从原核生物中分离纯化出来的
2. 种类：
数千种
4. 作用 :
（1）识别：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；
（2）切割：使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
二、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
3. 化学本质 :
蛋白质
酶的专一性
T
A
C
G
G
C
A
T
G
C
G
C
A
T
5
3
5
3
能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
二、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
相邻两个核苷酸之间的键：磷酸二酯键
切割
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
脱氧核苷酸
--GAATTC--
--CTTAAG--
二、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，例如EcoRⅠ、SmaⅠ，也有少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
5. 识别序列：
大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，例如EcoRⅠ、SmaⅠ，也有少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，
以EcoR I为例：
E：Escherichia （属名）
co：coli （种加词）
R：RY13 （品系）
I：分离出的第一种限制酶
资料卡 限制酶名字的由来
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一种限制酶
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一种限制酶。
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一种限制酶。
流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为： 。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
资料卡 限制酶名字的由来
G A A T T C
C T T A A G
5’
3’
3’
5’
中心 轴线
G
C T T A A
A A T T C
G
中心轴线两侧切开
黏性末端
EcoRⅠ
6. 作用结果：
产生DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种形式。
二、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
（1）EcoRⅠ 限制酶能特异性识别 序列（5’→3’方向），在识别序列的中心轴线两侧，切割 和 之间的 ，切割后产生 。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
C C C G G G
G G G C C C
5’
3’
3’
5’
中心 轴线
C C C G G G
G G G C C C
中心轴线处切开
平末端
SmaⅠ
6. 作用结果：
产生DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种形式。
二、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
（2）Sma I 限制酶能特异性识别 序列（5’→3’方向），在识别序列的中心轴线处，切割 和 之间的 ，切割后产生 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
平末端
Sma I 限制酶能特异性识别CCCGGG序列，切割C和G之间的磷酸二酯键，产生平末端。
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
G
G
A
T
C
A
T
C
A
T
A
T
EcoRⅠ限制酶能特异性识别GAATTC序列，切割G和A之间的磷酸二酯键，产生黏性末端。
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
限制酶
限制酶
6. 作用结果
二、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条链反向读的碱基序列完全一致，且在中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的（回文序列）。
注意（1）：限制酶识别序列的特点
EcoRⅠ
……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ
……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ
……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
TaqⅠ
………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
7. 注意
BamHⅠ ； EcoRⅠ ；Hind Ⅲ ；BglⅡ 。
【练习】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？
注意（2）：同种限制酶切割的黏性末端一定相同, 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。
注意（3）：在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割（需切两处），会产生4个末端。
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
黏性
末端
目的基因
—G AATTC—
—CTTAA G—
注意（4）：判断两个黏性末端是否为同一种限制酶切割产生
二、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
7. 注意
①一看裸露碱基是否相互配对；
②二看切割位点是否相同。
① —A
—TGATC
④ CTAGA—
T—
② CTAGT—
A—
③ —T
—AGATC
—A
—TGATC
CTAGA—
T—
①②
③④
②③ / ①④
讨论1：你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
思考 · 讨论
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
讨论2：限制酶来源于原核生物，为什么不切割自己的DNA分子？
思考 · 讨论
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶识别的特定核苷酸序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
注意（5）：限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用，以防止外来病原物的侵害，保证自身的安全。
注意（6）：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
7. 注意
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割（EcoRⅠ）
如何将苏云金芽孢杆菌抗虫基因与载体“缝合”
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
如何将苏云金芽孢杆菌抗虫基因与载体“缝合”
基因的针线：DNA连接酶
1. 作用：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
磷酸二酯键
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
2. 种类
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只能将具有互补 的DNA片段连接起来 “缝合”两种末端，但连接 的效率相对较低
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。 大肠杆菌
T4 噬菌体
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
注意：DNA连接酶没有识别序列的特异性
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
TCTTCATG
AGAAGTACTTAA
AATTCCCTAAG
GGGATTC
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
T4 DNA连接酶“缝合”两种末端，但连接平末端之间的效率相对较低。
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？（72页）
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
A A T T G
DNA聚合酶以DNA的一条链作为模板，连接游离的脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
以DNA的一条链为模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
3. DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
归纳总结：几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
DNA（水解）酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
归纳总结：几种相关酶的比较
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A. 切断a处的酶为_______
B. 连接a处的酶为_______
C. 切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
练一练：根据所学知识，完成以下填空
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具就是载体，被称为分子运输车。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1. 作用：
将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）常用载体：质粒
2. 种类
（2）其他载体：噬菌体、动植物病毒等
它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差别。
（1）概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3. 质粒
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3. 质粒
（2）在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
4. 作为载体需要具备的条件（以质粒为例）
（1）质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
（2）携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
一种应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的小型化穿梭质粒pSDU1，具有多克隆酶切位点MCS。
4. 作为载体需要具备的条件（以质粒为例）
（3）人工改造的质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选，如四环素抗性基因（tetr）、氨苄青霉素抗性基因（ampr）等。
（4）载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，不会影响受体细胞正常的生命活动。
有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别
有限制酶切割位点
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
能复制并带着插入的目的基因一起复制
大肠杆菌细胞
大肠杆菌及质粒结构模式图
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
知识扩展：标记基因的筛选原理
不存活
存活
根据图中的相关信息找到两条片段上EcoR I 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC- 3'
GCCGTATG- 5'
5' -TCCTAG
3' -AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC- 3'
GGTATG- 5'
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考 · 讨论 重组DNA分子
讨论1：剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；
透明胶条代表DNA连接酶。
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC- 3'
GCCGTATG- 5'
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考 · 讨论 重组DNA分子
讨论2：你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是
什么原因造成的？
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC- 3'
GCCGTATG- 5'
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考 · 讨论 重组DNA分子
可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
讨论3：你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC- 3'
GCCGTATG- 5'
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考 · 讨论 重组DNA分子
不能。
真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
1. 从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割 次此DNA分子，产生 个黏性末端。
2. 目的片段翻转过来，可以连接吗？ 。
3. 目的片段可以自身环化吗？ 。
4. 切割目的基因和载体时，一般可以用 限制酶，目的是 。
2
4
可以
可以
同种
产生相同的黏性末端
思考 · 讨论 重组DNA分子
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC- 3'
GCCGTATG- 5'
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
讨论4：回答下列问题
不一定，不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。
思考 · 讨论 重组DNA分子
讨论5：切割目的基因和载体时，必须是同一种限制酶吗？
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC- 3'
GCCGTATG- 5'
5' -TCCTAG
3' -AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC- 3'
GGTATG- 5'
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
1. 上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏 和 。
2. 在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后， 。
目的基因
抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
练习与应用
（1）选目的基因两端和载体都有的酶切位点；
（2）所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因。
方法总结
（1）切割目的基因时：能切下目的基因且不破坏目的基因；（2）切割质粒时：至少保留一个完整的标记基因，便于筛选。
2. 选择限制酶的注意事项
1. 选择限制酶切割位点的原则
下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子？（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因）
Hind Ⅲ和Pst Ⅰ
练习与应用
方法总结
3. 为避免目的基因和质粒的自身环化、目的基因反向连接到载体，应使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
1. 获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶，目的是：
。
但是使用该法缺点是容易发生 ，
为了避免上述情况发生，可采取的措施是：
。
为了产生相同的黏性末端，便于目的基因与载体连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体
目的基因、载体的自身环化以及目的基因与载体反向连接
练习与应用
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
1. 提取DNA的实验思路
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
2. 提取DNA的原理
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl溶液。
2 mol/L 的NaCI溶液中DNA溶解度 较大
0.14mol/L的NaCI溶液中DNA溶解度 较小
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。因此，二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
3. 鉴定DNA的原理
4. 选材与试剂
（1）选材：不同生物的组织中DNA含量不同，在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花或猪肝等。
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
4. 选材与试剂
注意：选材不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
猪血
思考：能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物成熟的红细胞作实验材料？
4. 选材与试剂
注意：以血液（如鸡血细胞）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
思考：能否选用鸡血细胞作实验材料？
鸡血
能，鸡是鸟类动物。
4. 选材与试剂
（2）试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
研磨液、二苯胺试剂配制方法参见P117页附录2
——破坏细胞，释放出细胞内的物质
二苯胺试剂要现配现用
用棕色瓶保存
研磨液成分 作用
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
EDTA 抑制DNA酶
SDS 使蛋白质变性
· 溶/瓦解细胞膜
· 使蛋白质变性与DNA分离
（2）试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用，水浴加热
4. 选材与试剂
（1）破碎细胞：称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
5. 实验步骤（以洋葱为例）
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
【思考1】如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。
【思考2】利用动物细胞提取DNA采取什么方法破碎细胞？
动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破（省去研磨步骤）
（1）破碎细胞：称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
5. 实验步骤（以洋葱为例）
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
过滤取上清液
5. 实验步骤（以洋葱为例）
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
（2）过滤，去除杂质：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
思考3：上清液中除了DNA之外，可能含有哪些杂质？
低温抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解。
思考1：4℃冰箱低温放置几分钟的作用？
思考2：过滤能否用滤纸代替纱布？
不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
（2）过滤，去除杂质
可能含有核蛋白、多糖、脂质等杂质。
5. 实验步骤（以洋葱为例）
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
（3）DNA的粗提取：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
析出DNA（草莓）
【思考3】为什么沿着一个方向缓慢搅拌？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
【思考2】为什么酒精溶液要预冷处理？
①可抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
（3）DNA的粗提取
【思考1】为什么使用酒精溶液粗提取DNA？
（4）NaCl溶液溶解DNA并鉴定：取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl的溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中颜色的变化。
5. 实验步骤（以洋葱为例）
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
1号试管 2号试管
加入2mol/L NaCl溶液
丝状物（DNA）
用玻璃棒搅拌
加入二苯胺试剂
沸水浴
冷却后，观察现象
不变蓝
变蓝
不加入
加入
5mL
5mL
4mL
5min
丝状物溶解
5min
4mL
无
DNA的鉴定
五、探究·实践——DNA的粗提取与鉴定
6. 实验结果
（1）若观察到提取的DNA的颜色不是白色，说明DNA中的杂质较多，可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
（2）二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的
平末端
C
练习与应用（P74）
一、概念检测
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A. 大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
练习与应用（P74）
一、概念检测
因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用（P74）
二、扩展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
练习与应用（P74）
二、扩展应用
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
练习与应用（P74）
二、扩展应用
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
练习与应用（P74）
二、扩展应用
T
G
C
C
G
T
A
A
本节结束！

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