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第二章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出及不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
1970年，有两位科学家做了一个人-鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。
回忆
一.动物细胞融合技术
1. 概念
动物细胞融合技术(也称细胞杂交)就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2. 原理：
动物细胞膜的流动性
回顾：植物体细胞杂交的原理是：
植物细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
3. 结果：
形成杂交细胞，即融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。
一.动物细胞融合技术
4. 诱导方法：
物理法：
化学法：
生物法：
振动、离心法、电融合法
聚乙二醇(PEG)融合法
灭活病毒诱导法，
如灭活的仙台病毒
植物体细胞杂交的特有诱导方法：
高Ca2+ - 高pH融合法；
动物细胞融合的特有诱导方法：
灭活病毒诱导法。
【P48相关信息】灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性(不感染细胞)
保留融合活性(诱导细胞融合)
【P49页旁栏思考】19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象
病人体内的病毒等诱导多个细胞融合形成了多核细胞。
5. 过程：
一.动物细胞融合技术
动物细胞融合的过程包括细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合。
其中细胞膜融合是细胞融合的先导，在细胞膜融合中体现出细胞膜具有一定的流动性，细胞融合的实质是核融合。动物细胞融合完成的标志是两个或多个细胞核融合为一个细胞核。
灭活病毒诱导细胞融合过程：
6. 意义：
一.动物细胞融合技术
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 。
7. 实例：
正在融合的鸡血细胞
正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞
8. 应用：
一.动物细胞融合技术
(1)成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
(2)用于制备______________。
单克隆抗体
9. 动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
融合前处理
诱导 方法
细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞膜的流动性
先除去细胞壁
方法：
先使细胞分散开
方法：
机械法、纤维素酶和果胶酶
胰蛋白酶或胶原蛋白酶
物理法：电融合法、离心法
化学法：PEG融合法、
高Ca2+ - 高pH融合法
物理法：电融合法、离心法
化学法：PEG融合法
生物法：灭活病毒诱导法
一.动物细胞融合技术
9. 动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合
过程
结果
应用
意义 克服了远缘杂交不亲和的障碍/实现远缘杂交，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合。
培育植物新品种
主要用于制备单克隆抗体
杂种植株
杂交细胞
细胞A、B 去壁 原生质体A、B
融合 融合的原生质体 再生出细胞壁 杂种细胞 植物组织培养(脱分化、再分化等) 杂种植株
细胞A、B 融合 杂交细胞
( 有丝分裂 多个相同杂种细胞)
时间 成果
19世纪30年代 观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞
1858年 观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
1875年 第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
1876年 在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。
1962年 日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1965年 英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合
1974年 华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1975年 Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
20世纪80年代 发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合)
【拓展】动物细胞融合技术的发展历史
随堂练习
1．关于动物细胞融合的说法，不正确的是(　　)
A．动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程
B．动物细胞融合后形成的具有两个动物细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞
C．常用的诱导动物细胞融合的方法有聚乙二醇、灭活的病毒诱导、电激、紫外线照射等
D．细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能
C
C　[常用的诱导动物细胞融合的方法有物理法——离心、振动、电激等；化学法——聚乙二醇(PEG)诱导；生物法——灭活的病毒诱导。紫外线照射不是诱导动物细胞融合的方法。]
20世纪90年代初，英国科学家成功地利用“生物导弹”单克隆抗体瞄准并杀死了癌细胞，使患血癌的一名67岁退休教授与一名女患者的癌细胞奇迹般消失了。被称为“生物导弹”的单克隆抗体，能够跟踪和杀死细菌、病毒或癌细胞。
传统抗体制备方法及缺陷：
1. 方法
向动物体内反复注射某种抗原
从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
2. 缺点：
二、单克隆抗体及其应用
(1)B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞分泌一种特异性抗体。(2)骨髓瘤细胞特点：能在体外大量　 　。(3)杂交瘤细胞特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能　　 　　又能产生大量　　 　　。
1．制备原理
增殖
特定抗体
无限增殖
B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞产生的具有特异性的抗体。
2. 单克隆抗体的概念：
单
克 隆
抗 体
克隆
一个
B淋巴细胞
细胞群
抗体
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验1984年，诺贝尔生理学或医学奖
阅读课本P48-49，了解单克隆抗体的制备过程
二、单克隆抗体及其应用
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
动物细胞融合
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
3. 制备过程
电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法等
B、瘤、BB 、B瘤 、瘤瘤
√
第一次筛选
第1次筛选目的：选出杂交瘤细胞。
二、单克隆抗体及其应用
3. 制备过程
第一次筛选
第二次筛选
第二次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
抗体
检测板
多孔细胞培养板
怎样再次筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？
方法：克隆化培养和专一抗体检测
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
分泌抗体能跟抗原结合的细胞即为所需细胞
阳性孔
实际选出来的是：骨髓瘤细胞与产生相应抗体的浆细胞融合成的杂交瘤细胞。
选必三 P50
思考·讨论：单克隆抗体的应用
【资料1 】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
单克隆抗体被广泛用作诊断试剂，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。例如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
选必三 P50
思考·讨论：单克隆抗体的应用
【资料2】 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（antibody-drug
conjugate，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
ADC的作用机制示意图
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞：药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
选必三 P50
思考·讨论：单克隆抗体的应用
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信言号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
选必三 P50
思考·讨论：单克隆抗体的应用
4. 单克隆抗体在临床上还有哪些应用 你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。
单克隆抗体 在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤;曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
选必三 P50
思考·讨论：单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
能准确地识别__________________，与特定抗原发生_____________，并且可以_____________。
4. 单克隆抗体的优点：
特异性结合
(1)作为_____________，具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于_____________和_____________。
5. 单克隆抗体的应用
抗原的细微差异
大量制备
诊断试剂
治疗疾病
运载药物
(1)作为诊断试剂——广泛应用
同位素标记的单克隆抗体，在特定组织中成像，定位诊断相关疾病。
准确、高效、简易、快速
5. 单克隆抗体的应用
①特异性强、灵敏度高
生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物
②疗效高、毒副作用小
结合同位素的单抗
-----生物导弹
(2)用于治疗疾病和运载药物
5. 单克隆抗体的应用
制备单克隆抗体过程中的两次筛选
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选原因
筛选方法
筛选目的
诱导融合后得到多种杂交细胞和未融合的细胞
从小鼠体内提取的B淋巴细胞有很多种，形成的杂交瘤细胞也有很多种。
用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
得到杂交瘤细胞
得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
单克隆抗体
筛选二
杂交细胞等
杂交瘤细胞
体外或
体内培养
筛选一
骨髓瘤
细胞
诱导融合
分泌特异抗体
的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞群
提取
已免疫的
B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
单克隆抗体的制备
既能迅速大量繁殖
又能产生专一抗体
特异性强
灵敏度高
可大量制备
注射
抗原
小结
随堂练习
1. 判断对错
(1)用特定的抗原对小鼠进行免疫后，从小鼠脾脏中只能得到一种B淋巴细胞。( )
(2)单克隆抗体是单个B淋巴细胞增殖并产生的抗体。( )
2. 由单克隆抗体研制而成的“生物导弹”由两部分组成，一是“瞄准装置”，二是杀伤性“弹头”，下列对此描述不正确的是( )
A. “瞄准装置”是由识别肿瘤的单克隆抗体构成
B. “弹头”是由放射性同位素、化学药物和毒素等物质构成
C. “弹头”中的药物有选择杀伤肿瘤细胞的功能
D. “生物导弹”是利用细胞工程制出来的
C
免疫后的小鼠从脾脏中获取的是多种B淋巴细胞。
单克隆抗体是杂交瘤细胞产生的抗体。
随堂练习
3. 下列关于单克隆抗体制备的说法，正确的是(　　)
A. 将特定抗原注射到小鼠体内，可以从小鼠血清中获得单克隆抗体
B. 经特定抗原免疫过的B淋巴细胞在体外培养时可分泌单克隆抗体
C. 诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，发生融合的细胞均为杂交瘤细胞
D. 筛选出杂交瘤细胞后，需利用特定抗原再次筛选分泌单克隆抗体的细胞
D
提示：制备单克隆抗体过程中，可在体外杂交瘤细胞的培养液中，或体内小鼠腹水中获得纯化的单克隆抗体，A错误；免疫过的B淋巴细胞高度分化，不能增殖，无法分泌单克隆抗体，B错误；发生融合的细胞可能有三种：B淋巴细胞－B淋巴细胞、B淋巴细胞－骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞－骨髓瘤细胞，C错误；制备单克隆抗体时，需筛选两次，第一次得到杂交瘤细胞，第二次得到既能无限增殖又能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，D正确。
随堂练习
4．下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT－)，在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述不正确的是(　 )
B
A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合
B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长
C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产
D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础
提示：诱导动物细胞融合的方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒(如灭活的仙台病毒)等，A正确；两两融合的细胞包括免疫B细胞与免疫B细胞融合的具有同种核的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的具有同种核的细胞、免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞虽然能无限增殖，但缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，免疫B细胞虽然有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，但不具有无限增殖的本领，所以在HAT筛选培养液中，两两融合的具有同种核的细胞都无法生长，只有杂交瘤细胞才能生长，B错误；因每个免疫B细胞只分泌一种特异性抗体，因此在HAT筛选培养液中筛选出来的众多的杂交瘤细胞所分泌的抗体，不一定都是人类所需要的，还需要进一步把能分泌人类所需要抗体的杂交瘤细胞筛选出来，C正确；动物细胞融合是以细胞膜的流动性为基础的，D正确。
【拓展】细胞内DNA的合成一般有两条途径，主要途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶的催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。如何利用DNA合成途径不同的特点配制培养基筛选出杂交瘤细胞？请说明原理。
提示：在培养基中加氨基喋呤就可以筛选出杂交瘤细胞。因为培养基中加入氨基喋呤后，骨髓瘤细胞和两两融合的骨髓瘤细胞由于其唯一的DNA合成途径被抑制而不能增殖。B淋巴细胞本身不增殖，两两融合的B淋巴细胞也不增殖，只有杂交瘤细胞通过辅助途径合成DNA进行增殖。
随堂练习
5.右图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述，正确的是( )
D
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应 T 淋巴细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群
B细胞属于悬浮生长类的细胞，无需用胰蛋白酶处理
随堂练习
6.下图为科研工作者利用小鼠制备H7N9禽流感病毒单克隆抗体的过程,请据图回答有关问题。
(1)图中将H7N9病毒抗原基因导入受体细胞常用的方法是　 　 。
(2)在受体细胞的培养过程中,为了防止污染,通常还要在细胞培养液中添加一定量的　　　　，其培养液与植物组织培养的培养基相比，特有的天然成分是　　　　　 　。
(3)图中X细胞一般选用　　　　　　，与植物体细胞杂交相比，诱导X细胞和Y细胞融合还可采用　　　 　　　　。
显微注射技术
抗生素
动物血清
骨髓瘤细胞
灭活的病毒
随堂练习
6.下图为科研工作者利用小鼠制备H7N9禽流感病毒单克隆抗体的过程,请据图回答有关问题。
(4)单克隆抗体的制备过程需要经过多次筛选,首先用特定的选择性培养基筛选出　　　 　，最终获得足够数量的　　　 　 的细胞，选出符合要求的细胞后，可在体外条件下或注射到　　　　　进行增殖培养。
(5)利用上述技术生产的单克隆抗体可制作成诊断盒,用于准确、快速诊断H7N9禽流感病毒的感染者,这种诊断运用了　　　 　　杂交技术，这体现了单克隆抗体 　　　　　　　 　的特性。
杂交瘤细胞
能产生所需抗体
小鼠腹腔
抗原 - 抗体
特异性强、灵敏度高
一、概念检测
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A．它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B．都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C．融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D．前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
练习与应用 （书本P51）
C
一、概念检测
2．科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A．利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B．体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C．将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D．将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
练习与应用 （书本P51）
A
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能用该技术培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。

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