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第2节 动物细胞工程
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
植物细胞融合
植物组织培养
运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同植物之间的生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。
问题：有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
植物体细胞杂交
温故知新，知识回顾：植物体细胞杂交的过程
1.概念：
2.原理：
3.融合的实质：
4.结果：形成_____细胞。(植物：形成____细胞、杂种植株)
5.诱导融合的常用方法：
6.意义：
7.应用：
8.比较：动物细胞融合和植物体细胞杂交的异同
细胞膜的流动性。
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法。
（化学法、 物理法、 生物法 ）
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
细胞核的融合。
01
（一）动物细胞融合技术
动物细胞融合特有
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术（1个核还是多核？）。
融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
杂交
杂种
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合实质及完成的标志：
相关信息
细胞核的融合
书本P49右上角问题：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
答案：病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
书本P49右上角问题：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。8.比较：植物体细胞杂交和动物细胞融合的异同
比较 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
步骤 酶解法去掉 后，诱导 融合，形成 ，再经植物组织培养形成 。 分散成 后诱导细胞融合，形成 。
融合 方法 PEG融合法、电融合法、
诱导法
结果 形成____________ 形成 ，以生产细胞产品
意义 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
细胞膜的流动性
细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞壁
原生质体
杂种细胞
杂种植株
单个细胞
杂交细胞
灭活病毒
杂种植株
杂交细胞
（一）动物细胞融合技术
聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2＋—高pH融合法、电融合法、离心法
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
果胶酶、纤维素酶去细胞壁
胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；PEG融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
8.比较：植物体细胞杂交和动物细胞融合
阅读课本P49--50，思考下列问题：
1.抗体的本质是什么？分泌抗体的细胞是？体液免疫的过程？
2.早期获得抗体的方法是？其缺点是？
3.大量制备单一抗体的思路和需解决的问题？
4.单克隆抗体的概念？制备思路？
5.单克隆抗体制备的过程？
6.单克隆抗体有哪些应用？
2.（1）早期获得抗体的方法：
向动物体内反复注射某种抗原，动物产生抗体→从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
（2）缺点：
（二）单克隆抗体的制备
1.抗体的本质是什么？分泌抗体的细胞是？体液免疫的过程？
浆细胞
抗体(蛋白质）
抗原
B细胞
激活
增殖、分化
3.大量制备单一抗体的思路和需解决的问题
体内抗体超百万种。但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
选择
单一B淋巴细胞(浆细胞)
克隆
(增殖)
细胞群
产生
大量纯度高特异性强的抗体
问题：体外培养时，B淋巴细胞不能无限增殖
什么细胞能无限增殖？
癌细胞(恶性肿瘤)
4.大量制备单一抗体，选取什么细胞与何种细胞融合？5.什么是单克隆抗体？
病原体
处理
呈递
辅助性T细胞
辅T,与B,结合
记忆B细胞
浆细胞
抗体
病原体与B细胞接触（第一信号）
分裂、分化 并分泌
细胞因子
分裂分化
促进
产生分泌
（第二信号）
B细胞
抗原呈递细胞
摄取
任务一：【模型构建】请结合P72图4-6及P73第1段，完成体液免疫的过程图解。
二、(一)体液免疫
①
②
③
④
⑤
⑥
吞噬细胞吞噬消化
形成的记忆细胞有什么作用？
①抗体与病原体特异性结合，之后发生进一步变化，如形成沉淀等，进而被其他免疫细胞（如巨噬细胞）吞噬消化。
②抗体能抑制病原体的增殖或对人体细胞的黏附。
抗体的作用？
相同病原体再次入侵（二次免疫反应）特点 ？
增殖分化
抗原呈递细胞(APC )：树突状细胞、B细胞、巨噬细胞
反应更快速、作用更强烈，产生的抗体更多。
当再次接触同种抗原（二次免疫）时，记忆B细胞能迅速增殖分化形成新的记忆B细胞和浆细胞，浆细胞快速产生大量抗体。
5. (1) 什么是单克隆抗体？
(2)制备单克隆抗体的思路（大概过程 ）
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
动物细胞 融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞：
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
由单一杂交瘤细胞克隆(增殖)产生的特异性抗体
(B淋巴细胞+骨髓瘤）
4.制备单一抗体，选取什么细胞与何种细胞融合？为什么选它？
①B淋巴细胞（能产生特异性抗体）；
②骨髓瘤细胞（能无限增殖）。
6. 单克隆抗体制备的具体过程：（非常重要）
英国
米尔斯坦
德国
科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
6. 单克隆抗体制备的过程：（非常重要）
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
从脾中提取
B淋巴细胞
多种
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
①部分是不产生抗体的B细胞：B细胞和记忆B细胞
②产生B1、B2、B3等不同抗体的B细胞(浆细胞)
目的：获得能产生特定抗体的B淋巴细胞(浆细胞)
（不是为了得到单克隆抗体）
理论上共有几类融合情况？若只考虑两两融合有几种？符合要求的是哪种？
3类；未融、两两、多C融合
①B+B淋巴细胞融合
②骨+骨髓瘤细胞融合
③B细胞+骨髓瘤
(杂交瘤细胞)
√
（能无限增殖）
多种杂交细胞
未融合的细胞
瘤-瘤
B-B
第一次筛选：
用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
筛选1得到：杂交瘤细胞
(杂交瘤C:既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
(此时的抗体，一定都是所需抗体吗？)
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测
（多次筛选）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞（每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞）
克隆化培养：
筛选2：获得足够数量的，能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
分泌的抗体能与特定抗原结合
瘤-记忆B、瘤-B1、瘤-B2、瘤-B3…
有限稀释法
检测原理：抗体与特定抗原的特异性结合(分子水平的鉴定）
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
筛选获得杂交瘤细胞
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
7.两次筛选的比较
（体内培养：注射到小鼠腹腔内
体外培养（培养皿，松盖培养瓶）
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
6.单克隆抗体制备的过程：
8.培养部位？提取抗体位置？
9.单克隆抗体的优点：能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
单个杂交瘤细胞增殖产生高度纯一的抗体
8.培养部位？
提取抗体位置？
9.单克隆抗体的优点：
特异性强
灵敏度高
可大量制备
7.制备单克隆抗体的过程：
10.原理？
动物细胞融合（原理：细胞膜的流动性）
动物细胞培养（原理：细胞增殖）
单克隆抗体
杂交细胞
1筛选出：杂交瘤细胞
体外或
体内培养
第一次筛选
骨髓瘤细胞
诱导融合
2筛选出:足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞群
提取
已免疫的B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
特点：
特异性强
灵敏度高
可大量制备
注射抗原
二、单克隆抗体及其应用
单克隆抗体的制备小结
选择性培养基上培养
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
特点：既能大量繁殖又能产生专一抗体
拓展延伸：【第一次筛选】获得杂交瘤细胞
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
培养基中加入氨基嘌呤
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
二、单克隆抗体及其应用
单克隆抗体的制备小结
（1）该过程中应用到的技术_______________________________________
（2）原理_______________________________________
（3）注射特定抗原的目的______________________________________________
（4）诱导融合的方法______________________________________
动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
（5）第一次筛选的目的______________________
第一次如何筛选___________________________
筛选原理____________________________________________________
_____________________________
筛选 获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
二、单克隆抗体及其应用
单克隆抗体的制备小结
（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________
（7）第二次筛选的目的________________________________________________
如何筛选_______________________________________ ____________
选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________ _____________
（8）抗体检测原理_______________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养___________________________
②小鼠腹腔内培养_________________________
（11）单克隆抗体的优点_____________________________
_________________________________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
阳
思考·讨论 （三）单克隆抗体的应用
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。(女性怀孕会产生人绒毛膜促性腺激素，尿中会检出）
①作为诊断试剂——最广泛应用
讨论：
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
抗体：靶向运输药物，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。
药物：发挥治疗效应，如杀伤肿瘤靶细胞
ADC
(2)用于运载药物
思考·讨论 （三）单克隆抗体的应用
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
①检测的特异性和灵敏度大大提高；有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
4.提示：单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例,用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
概述
应用
动物细胞融合
技术
过程
结果
意义
原理
融合方法
原理
应用
单克隆抗体的制备
免疫处理
第一次筛选
诱导融合
第二次筛选
大规模培养
诊断试剂
运载药物
治疗疾病
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔
课堂小结
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题 解决这些问题的大致思路是怎样的 这样做会有什么风险 请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
练习与应用
二、单克隆抗体及其应用
(四)单克隆抗体的运用：
1.作为诊断试剂——最广泛的应用
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点：
二、单克隆抗体及其应用
(四)单克隆抗体的运用：
2.用于治疗疾病和运载药物
(主要用于癌症治疗)如：单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
优点：位置准确、疗效高、副作用小
结合同位素的单抗
(“生物导弹” —单抗导向，药物为弹头)
二、单克隆抗体及其应用
(四)单克隆抗体的运用：
2.用于治疗疾病和运载药物
细胞凋亡
ADC的作用机制示意图
①
ADC被细胞吞噬
②
⑤
ADC
抗体
药物
接头
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC
实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
二、单克隆抗体及其应用
(四)单克隆抗体的运用：
2.用于治疗疾病和运载药物
脂质体给药
高效 低毒 靶向
抗肿瘤药物载体：阿霉素脂质体和顺铂脂质体已在国外上市。
二、单克隆抗体及其应用
(四)单克隆抗体的运用：
2.用于治疗疾病和运载药物
单克隆抗体不仅可以运载药物，而且自身也能用于治疗疾病。
单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
排名 药物 中文名 销售额(亿美元) 适应症 类型
1 Humria 修美乐 199.36 自身免疫疾病 单抗
6 Herceptin 赫赛汀 70.32 乳腺癌等多种癌症 单抗
7 Avastin 安维汀 68.98 结肠癌等多中癌症 单抗
8 Rituxan 美罗华 68.01 白血病 单抗
9 Opdivo 纳武单抗 67.35 多种肿瘤 单抗
2018年全球药物销售额排名前10的单抗药物
修美乐已连续8年蝉联榜首,2021年新冠疫苗(mRNA疫苗)位居榜首，修美乐位居第二位。

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