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第3章 基因工程
3.2 基因工程的基本操作程序 第2课时
——将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定
1
2
阐明将目的基因导入受体细胞的方法
阐明目的基因的检测与鉴定的方法
学习目标
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，分别适用于什么生物？
在获得转基因产品的过程中，受体细胞有植物、动物、微生物之分，受体
细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同。
核心
一、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞的方法
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法（常用）
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
（我国科学家独创）
一、将目的基因导入受体细胞
在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
1.花粉管通道法
（我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法）
导入植物细胞
操作方式：
一、将目的基因导入受体细胞
能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种 植物也取得了成功。
农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的_______可转移至被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 。
（2）转化原理：
（1）农杆菌的特点：
T-DNA
Ti质粒
大型环状DNA
农杆菌
T-DNA
染色体DNA上
单子叶
Ti质粒
2.农杆菌转化法
导入植物细胞
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受
体细胞内维持稳定和表达的过程。
一、将目的基因导入受体细胞
(3)过程：
植物组织培养
第一次导入
第二次导入
第一次拼接
第二次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
2.农杆菌转化法
一、将目的基因导入受体细胞
目的基因的表达载体提纯
取卵（受精卵）
显微注射
受精卵发育
获得具有新性状的动物
导入动物细胞
——显微注射法
①个体大，易操作。
②受精卵全能性高，易培养成完整个体。
一、将目的基因导入受体细胞
Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
过程：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，
需要在体外进行再加工。
导入微生物细胞
——Ca2+ 处理法
二、目的基因的检测与鉴定
基因表达载体中已经具备标记基因（如抗生素抗性基因），对受体细胞进行了筛选，为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？
在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。
二、目的基因的检测与鉴定
①检测目的基因是否导入
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
——通过PCR等技术检测
转基因生物
提取DNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
电泳操作
1.分子水平的检测
二、目的基因的检测与鉴定
②检测目的基因是否转录
如：检测Bt基因是否翻译出mRNA
——通过PCR等技术检测
提取棉花细胞mRNA
逆转录
产生DNA
对扩增产物进行检测
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
1.分子水平的检测
二、目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
——通过抗原—抗体杂交检测
1.分子水平的检测
蛋白质
脱分化
提取
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
抗体
出现杂交带
二、目的基因的检测与鉴定
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗性鉴定、活性鉴定等
2.个体水平检测：
二、目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
基因工程的基本操作程序流程图
课堂小结
练一练 P83【练习与应用】
一、概念检测（P83）
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒
上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表
述是否正确。
(1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 ( )
(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。( )
(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。( )
×
×
√
练一练 P83【练习与应用】
一、概念检测（P83）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 ( )
A . PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B .变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C .复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D .延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP 和4种核糖核苷酸
D

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