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第二章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
第1课时 动物细胞培养
从社会中来
第一块人工合成皮肤是由白克和亚诺斯发明的，这两位科学家利用鲨鱼软骨和来自牛皮中的胶原蛋白为原料发明了一种人造皮肤。在1981年，白克和亚诺斯第一次将其发明的人造皮肤用于临床，患者是一位身体一半面积被烧伤的女士。剥离掉烧伤的皮肤之后，白克应用了一层人造皮肤，并且，在条件允许的情况下，将患者的未烧伤皮肤移植到烧伤部位。三星期过后，这位女性患者新生皮肤的生长速度惊人，并且颜色与未烧伤皮肤一样。在此基础上的改进产品称为integra人造皮肤，它不仅起着临时性替代功能，并且可以刺激毛细血管、成纤维细胞和巨噬细胞等逐渐从伤口向人造皮肤内生长。
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人
的健康皮肤进行自体移植。
但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建的人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增。
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
动物细胞培养
1. 概念
动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成___________，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和_______的技术。
单个细胞
增殖
2. 目的：
获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
3. 原理：
细胞增殖（有丝分裂）
回顾：植物组织培养的原理是：
细胞的全能性
4. 地位：
其他动物细胞工程的基础
5. 实例：
人造皮肤
（1）生物制品：酶、生长因子、疫苗、单克隆抗体等
（2）进行有毒物质和药物的检测
（3）临床治疗：人工皮肤等
（4）生物学基础研究 ：细胞全能性的揭示、细胞周期及调控、癌变机理及细胞衰老的研究
动物细胞培养
6. 意义
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养的条件
营养条件
其他条件
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
一、动物细胞培养的条件
1. 营养
将细胞所需的营养物质（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按种类和所需量严格配制的培养基。
（1）培养基构成：
合成培养基
血清等一些天然成分
＋
合成培养基：
血清等一些天然成分：
含有尚未研究清楚的细胞所需的营养物质
（2）培养基类型：
液体培养基（培养液）
【思考】动物细胞培养为什么需要加血清？
血清可提供一个类似生物体内的环境，其中还含有必需氨基酸、激素、酶、多种未知的促细胞生长/贴附因子等多种活性物质，可促进细胞生长和增殖。
一、动物细胞培养的条件
2. 无菌、无毒的环境
（1）具体操作：
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
②在无菌环境下进行操作。
③培养液需要定期更换：
营养物质被耗尽；
清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
（2）需要无菌、无毒的环境的原因？
一、动物细胞培养的条件
3. 温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以___________为宜；
36.5±0.5℃
（2）适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为________
7.2-7.4
（3）适宜的渗透压：
目的________________________。
维持细胞正常的形态和功能
一、动物细胞培养的条件
4. 气体环境
（1）动物细胞培养所需的主要气体组成及作用：
O2：
CO2：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）具体操作：
在进行细胞培养时，通常采用_________或_____________。
置于含有______空气和_____CO2的混合气体的____________中进行培养。
培养皿
松盖培养瓶
95%
5%
CO2培养箱
二、动物细胞培养的过程
阅读教材44-45页，思考以下问题:
1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？
2、为什么将取出的组织分散成单个细胞？
3、如何将组织分散成单个细胞？
4、细胞培养用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶可以吗？
5、胰蛋白酶会把细胞消化掉吗？若不会，为什么？若会，怎么控制？
6、大多数动物细胞的生长特性
7、什么是原代培养、传代培养？
8、10代以内的细胞的遗传物质有何特点？10代以后的？
二、动物细胞培养的过程
1. 取动物组织
（1）取材:
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
（2）取材原因:
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
（1）将组织分散成单个细胞
①方法:
机械法、
用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
②原因:
Ⅰ.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；
Ⅱ.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。
2. 制成细胞悬液
【P44旁栏思考题】进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜 pH 约为 2，当 pH 大于 6 时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜 pH 为 7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。在细胞培养中使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
处理过度的话，会把细胞消化掉，所以使用时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
【思考】胰蛋白酶会把细胞消化掉吗？若不会，为什么？若会，怎么控制？
二、动物细胞培养的过程
3. 原代培养
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
（1）操作方法：
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
（2）体外培养的动物细胞类型
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
②贴壁生长类：
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
除受密度、有害代谢物、营养物质影响外，还会发生接触抑制现象。
接触抑制：
要求：
培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞贴壁：大多数体外培养的细胞需要______________________才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的_____上，这种现象称为细胞贴壁.
贴附于某些基质表面
瓶壁
资料：动物细胞生长特性
癌细胞细胞膜上糖蛋白减少，细胞的黏着性降低，在适宜的条件下可以无限增殖，因此培养的癌细胞无接触抑制现象，在培养瓶中能够生长成多层。
【思考】根据癌细胞的特点，思考一下培养的癌细胞有没有接触抑制现象？
【思考】动物细胞培养过程中有接触抑制现象，这一现象说明了细胞膜具有什么功能？细胞膜接受信息后，细胞停止分裂又说明了什么？
细胞培养过程中的接触抑制说明了细胞膜能进行细胞间的信息交流。细胞膜接受信息后，细胞停止分裂，说明了细胞膜接受的信息能够传递到细胞核 。
接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。
4. 分瓶、进行传代培养
二、动物细胞培养的过程
（1）需分瓶进行传代培养的原因：
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
（2）方法：
①收集细胞
a.悬浮生长类：直接用_________收集
离心法
b.贴壁生长类：重新用_____________等处理，使之分散成单个细胞，然后再用_________收集
胰蛋白酶
②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
离心法
通常将__________的细胞培养，即动物组织经处理后的____________称为原代培养。（10代内）
传代培养：当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内的过程。
将_________的细胞培养称为传代培养。（10代后）
重要名词解释
分瓶前
初次培养
分瓶后
分瓶培养
10代细胞
50代细胞
无限增殖
10代内：保持细胞正常二倍体核型
10-50代：部分细胞核型改变
50代后：遗传物质改变突破细胞寿限
危机1
危机2
培养危机：
原代培养
传代培养
（遗传物质没改变）
（有的细胞遗传物质改变）
拓展
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，将这种能传到40-50代的细胞筛选出来进行传代培养。这种传代细胞为细胞株（遗传物质没有发生变化）。
细胞系：细胞株传代至40~50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。这种传代细胞为细胞系。
拓展
细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
区别：
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞系：传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
拓展
细胞悬浮液
细胞株
10代细胞
50代细胞
细胞系
无限传代
原代培养
传代培养
遗传物质改变
原代培养、传代培养、细胞株、细胞系四者之间的关系
拓展
▲注意
（1）传代培养的细胞在传到50代后，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。
（2）癌细胞失去了接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。
（3）目前用于冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的细胞，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质没变)。
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
细胞贴壁
接触抑制
二、动物细胞培养的过程
1．幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞生命力更旺盛，易于培养。同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，越容易培养。
选必三 P45
思考·讨论：有关动物细胞培养的问题
2．动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
可以从培养的原理，所需的营养条件、环境条件以及培养的过程等方面进行分析比较。
植物组织培养与动物细胞培养的比较
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的 物理性质
培养基 的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分、无机营养成分、植物激素
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清
植物激素
血清
植物组织培养与动物细胞培养的比较
植物组织培养 动物细胞培养
特殊环境条件
结果
是否体现细胞的全能性
过程
相同点 脱分化避光、再分化需光
气体环境
一般获得新的植株
获得大量细胞
是
否
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
芽、根
幼苗
完整植株
移栽成活
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
▲注意
(1)植物组织培养最终产生新个体，体现了细胞的全能性；动物细胞培养产生大量细胞，不形成新个体，故不能体现细胞的全能性。
(2)动物细胞培养一般不需经过脱分化过程，因为高度分化的动物细胞全能性变小，基本失去发育成完整个体的能力。要想使培养的动物细胞定向分化，通常定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。
随堂练习
1. 下列属于动物细胞培养与植物组织培养区别的是(　 　)
A．动物细胞培养基与植物细胞培养基的成分有所不同
B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C．动物细胞培养可发生遗传物质改变，而植物组织培养不能
D．植物组织培养和动物细胞培养都体现了细胞的全能性
A
提示：动物细胞培养所用的培养基与植物组织培养所用的培养基的成分不同，如培养动物细胞的培养基需加入血清，而植物组织培养所用的培养基则不需加入血清；动物细胞培养与植物组织培养都需要在无菌、人工控制的条件下进行；动物细胞培养与植物组织培养过程中都可发生遗传物质的改变；植物组织培养最终能够形成完整的植物体，能体现植物细胞的全能性，动物细胞最终不能被培养成新的动物，不能体现动物细胞的全能性。
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
动物胚胎、幼龄动物
机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理将组织分散成单个细胞
用培养液将细胞制成细胞悬液
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖
大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
回顾动物细胞培养的过程：
第二章 细胞工程
第1节 动物细胞工程
第1课时 动物细胞培养
选必三 P46
授课教师：XXX
三、干细胞培养以及应用
1. 概念：
三、干细胞培养及其应用
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
2. 分布：
干细胞存在于____________、_______和_________等多种组织和器官中。
早期胚胎
骨髓
脐带血
3. 类型：
存在或来源 功能及应用
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞
诱导多能 干细胞 (iPS细胞)
阅读P46-47，完成下列表格。
早期胚胎
能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体
成体组织或器官，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的造血干细胞。
具有组织特异性，
只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的潜能。
体外诱导体细胞产生
能分化成为具有特定功能的细胞，用于治疗疾病。诱导过程无须破坏胚胎，可避免免疫排斥反应。
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
造血干细胞是发现最早、研究最多、应用最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
4. 应用：
三、干细胞培养及其应用
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
（1）应用原理：
（2）应用实例：
造血干细胞：
神经干细胞：
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
（3）面临的问题：
存在导致肿瘤发生的风险
（4）应用展望：
5. 诱导多能干细胞（iPS细胞）
三、干细胞培养及其应用
（1）胚胎干细胞的局限性：
胚胎干细胞必须从_______中获取 ，涉及伦理问题，因而限制了在医学上的应用。
胚胎
伦理问题
（2）诱导多能干细胞概念：
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
诱导方法：
①将特定基因或特定蛋白导入细胞。
②用小分子化合物诱导形成。
（3）诱导多能干细胞优点：
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
（成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞、）
5. 诱导多能干细胞（iPS细胞）
三、干细胞培养及其应用
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
（4）诱导多能干细胞的应用：
可治疗镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
【思考】诱导多能干细胞用于治疗人类的某些顽症的原理是什么？
诱导多能干细胞类似胚胎干细胞，可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。
【思考】诱导多能干细胞为什么可以解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题？
通过干细胞体外诱导分化，可以培育出人造器官，从而解决供体器官不足的问题。另一方面，由于是自身细胞经诱导分化形成的，所以无免疫排斥反应。
随堂练习
1. 判断对错
(1)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。( )
(2)培养动物细胞的第一代(即第一次细胞增殖)被称为原代培养。( )
2．实验小鼠皮肤细胞培养的基本过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．甲过程需要在无菌条件下进行
B．乙过程可用胰蛋白酶处理皮肤组织
C．丙过程是原代培养出现接触抑制现象
D．丁过程是传代培养细胞，不出现接触抑制现象
D
随堂练习
3．人脐带间充质干细胞在特定诱导条件下，可分化为脂肪、肝、神经等多种组织细胞。下图表示培养人脐带间充质干细胞的大致过程。下列有关叙述错误的是(　　)
A．人脐带间充质干细胞属于
一种iPS细胞
B．通过离心除去上清液可以
除去胰蛋白酶
C．过程①通常用胰蛋白酶处理
D．出现接触抑制前，培养瓶中的细胞数量有可能呈“J”形增长
A
提示：iPS细胞是经人工诱导产生的，脐带间充质干细胞不是诱导多能干细胞。
随堂练习
4．关于iPS细胞及应用的说法，正确的是(　　)
A．iPS细胞是从早期胚胎中获取的
B．造血干细胞是一种iPS细胞
C．采用不同的方法可将成纤维细胞诱导产生iPS细胞
D．诱导iPS细胞发生基因突变，可使其分化成各种组织细胞
C
D×iPS细胞分化成各种组织细胞是基因选择性表达的过程。
随堂练习
5．某研究小组进行药物实验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题。
(1)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量_____。
(2)在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是_________________________________________。细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是__________________。
血清可以补充合成培养基中缺乏的物质
维持培养液的pH
多
随堂练习
5．某研究小组进行药物实验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题。
(3)在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长________。药物实验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更_____。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需要用__________处理。
(4)为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的____________。
抗生素
停止
多
胰蛋白酶
一、概念检测
1. 判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。（ ）
2. 干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是（ ）
A．干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B．造血干细胞可以分化为各种血细胞
C．不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D．由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
练习与应用 （书本P47）
A
二、拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导产生iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病
发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立 HLA（Human Leukocyte Antigen，人类白细胞抗原）多态性丰富的 iPS 细胞库，可以为需要的人找到 HLA 匹配度较高的 iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
二、拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；
获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；
获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。
该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的 iPS 细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择 iPS 细胞，从而“设计”婴儿。

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