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(共42张PPT)
1.2.1微生物的基本培养技术
经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，在经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是制作过程中有杂菌混入。
需先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术
从社会中来
19世纪中期，法国酿酒业曾一度遭到毁灭性打击，生产的葡萄酒出现了变酸变味的怪事…
法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了微生物。
一、微生物的概述
一、微生物的概述
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
1.微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、
乳酸菌等；
放线菌：链霉菌等
一、微生物的概述
（个体无法用肉眼观察的微小生物）
1）细菌的形态
杆菌
球菌
霍乱弧菌
葡萄球菌
螺旋菌
一、微生物的概述
2）微生物生长繁殖产生的菌落
沙门氏菌
毛霉
一、微生物的概述
一个细胞繁殖而来的
肉眼可见的子细胞群体（课本P12）
①要为人们需要的微生物提供合适的___________条件。
②要确保 ，并将需要的微生物分离出来。
营养和环境
其他微生物无法混入
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。
——培养基
——无菌技术
2、实验室培养微生物条件
【自主探究】请结合教材P9-10面，思考这些问题的答案。
1.培养基的用途有哪些？
2.培养基的必备营养成分有哪些？
3.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。
4.培养基的种类有哪些？
二、培养基的配制
1、培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
3、培养基类型：
固体
培养基
液体
培养基
有无琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养、
工业生产
2、培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
（ ①提供微生物繁殖所需各种营养， ②异养微生物的能源）
二、培养基的配制
注意：加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。
4、培养基的营养构成:
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
①碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
②氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
③无机盐：
Ca、K 、Mg为大量元素
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素
凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。
二、培养基的配制
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）
（2）还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
举例说明：
培养乳酸菌需要添加维生素
培养霉菌时需将PH调至酸性，培养细菌时将PH调至中性或弱碱性
培养厌氧微生物时需要提供无氧条件
牛肉膏
蛋白胨
4、培养基的营养构成:
凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。
二、培养基的配制
(1)用于发酵的微生物主要指细菌和真菌(　　)
(2)培养基中加入琼脂的目的是提供碳源(　　)
(3)所有微生物在培养时，培养基中都需加入氮源(　　)
(4)培养不同微生物的培养基成分完全一样(　　)
1.判断正误
√
×
×
×
课堂巩固
2.关于微生物的营养，下列说法正确的是
A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源 B.凡是碳源都能提供能量
C.除水以外的无机物仅提供无机盐 D.无机氮源也可能提供能量
√
3.下列有关培养基的叙述，正确的是
A.微生物的培养都需要提供水、碳源、氮源、无机盐，缺一不可
B.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
C.培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性
D.培养基只能培养细菌
√
课堂巩固
【自主探究】请结合教材P10-11面，思考下列问题：
1.获得纯净培养物的关键是什么？
2.消毒和灭菌的区别是什么？
3.为了防止杂菌污染，具体措施有哪些？（四个方面）
4.如何针对不同的作用对象选择合适的消毒/灭菌方法？
三、无菌技术
泛指在培养微生物的操作中，避免杂菌污染的方法。
两个方面：
消毒
对操作的空间、操作者的衣着和手
灭菌
培养细菌用的培养基与培养皿
玻棒、试管、烧瓶、吸管和接种环等
还要注意：
避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触。
为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
三、无菌技术
目的：①防止培养物被污染；②防止感染实验操作者。
消毒
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
1.概念：
2.消毒的方法：
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法：62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台
三、无菌技术
灭菌
1.概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
三、无菌技术
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
知识拓展
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
知识拓展
灭菌
1.概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
2.灭菌的方法：
①灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位
三、无菌技术
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h
三、无菌技术
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的
某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
对象：培养基等
注：使用后的培养基必须灭菌后
才能丢弃，以免污染环境。
③湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min
高压蒸汽灭菌锅
三、无菌技术
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,
160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,
生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
无菌技术的关键：防止外来杂菌入侵。
生物消毒法（P10旁栏）
利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。
例如，有的微生物能够寄生在多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用他们来净化污水、污泥。
培养物：在微生物学中，将接种于 内，在合适条
件下形成的含 的群体。
培养基
特定种类微生物
纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。
纯培养物：由 所获得的微生物群体。
单一个体繁殖
四、微生物的纯培养
常用方法： 法和 法。
微生物群
分散
单个细胞
单个菌落
繁殖
不同菌落的形状、大小、颜色等不同。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
方法步骤：制备培养基→灭菌→接种→分离→培养
1、制备培养基
1）配制培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml.
2）灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min.将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h.
包器材
四、微生物的纯培养
称取去皮的马铃薯200g
切成小块
加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂
用纱布过滤
滤液中加入20g葡萄糖，15~20g琼脂
用蒸馏水定容至1000mL
得到滤液
方法步骤
1、制备培养基
1）配制培养基
四、微生物的纯培养
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞
包上牛皮纸，并用皮筋勒紧
压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15 ~ 30min
取5 ~ 8套培养皿
培养皿叠成一束
用几层牛皮纸包紧
放入干热灭菌箱内，160 ~ 170℃灭菌2h
方法步骤
1、制备培养基
2）灭菌
四、微生物的纯培养
倒平板的具体操作：
3）倒平板
——待培养基冷却至50左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
四、微生物的纯培养
方法步骤
1、制备培养基
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，
这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要使用这个平板。防止空气中的微生物在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在
以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌彻底？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，
又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
问题探讨
2、接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
(1)原理：
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
(2)“平板划线”实验操作
四、微生物的纯培养
连续划线法
分区划线法
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
③试管口通过火焰
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接（第1区和第5区）
③每次划线前对接种环进行灼烧灭菌
④划线后，培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
四、微生物的纯培养
分区划线法
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上原有微生物。
杀死上次划线时残留菌种，
使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端
杀死接种环上残留的菌种，
避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。
实验分析
酵母菌的纯培养
Pure culture of yeast
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
3.培养酵母菌
四、微生物的纯培养
1.培养基的制作是否合格？
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
3.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
2.如何记录实验结果？
培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等
（培养时间越长，菌落越大、颜色越深）
4.结果与分析
四、微生物的纯培养
稀释涂布平板法
平板划线法
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。 （ ）
×
√
×
练习与应用P14
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
接种。
练习与应用P14
培养皿和培养基。
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？
培养液中O2含量不同。
练习与应用P14
（2）从图中数据你可以得出什么结论 原因是
培养液中O2含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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