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(共30张PPT)
2.2.1 动物细胞工程
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建的人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程
是最基础的技术
什么是动物细胞培养？动物细胞培养的作用？
克隆猴：中中和华华
克隆皮肤
单克隆抗体
【思考】：动物组织的选择： 幼龄动物 or 老龄动物
幼龄个体的细胞分化程度低、分裂能力强，易培养。
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
原理
地位
对象
目的
细胞增殖（有丝分裂）
动物细胞工程的基础
获得细胞或者细胞产物
胚胎或幼龄动物的细胞
一、动物细胞培养的概念
动物细胞培养所需的基本条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
二、动物细胞培养的条件
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件。你还记得有哪些条件吗？
充足的营养
稳定的内环境
体外培养动物细胞需要满足什么条件？
葡萄糖
氨基酸
无机盐
维生素
1、营养条件
【思考】：
培养基的类型： 固体培养基　or　液体培养基
合成培养基 or 天然培养基
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基
由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。
血清可以补充合成培养基中缺乏的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等。
？
动物血清
二、动物细胞培养的条件
液体培养基，也称培养液
培养基的构成：合成培养基 + 血清等天然成分
二、动物细胞培养的条件
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液
无菌
无毒
2、无菌、无毒的环境
③添加一定量的抗生素
在细胞培养液中添加适量的抗生素
思考：如何防止培养过程中的微生物污染？
思考：为什么要定期更换培养液？
以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
3、温度、pH和渗透压
一般与动物体内相同
①适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以______________为宜；
36.5±0.5℃
②适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为___________
7.2-7.4
③维持适宜的渗透压的目的：
维持细胞正常的形态和功能
二、动物细胞培养的条件
二、动物细胞培养的条件
（1）气体组成及作用：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）具体操作：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
CO2培养箱
培养皿
培养瓶
4、气体环境
O2：
CO2 ：、
动物细胞培养的过程
课本P44-45
1.为何动物细胞培养过程要将组织分散成单个细胞呢？
可用什么方法？
2.体外培养动物细胞有哪些类型？
3.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
4.什么是原代培养和传代培养？
5.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？
6.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处？
阅读教材P44-45,思考并回答下列问题：
思考(课本P45思考·讨论第1题)：
为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？
取动物组织
(幼龄动物)
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
因为这些细胞分化程度低，分裂能力强，容易培养
1. 取动物组织
三. 动物细胞培养的过程
思考：
为什么将取出的组织分散成单个细胞？
取动物组织
(幼龄动物)
①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖
②利于细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换
(1)将组织分散成单个细胞
制成
细胞悬液
分散成单个细胞
①机械的方法
②用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
(2)用培养液将细胞制成细胞悬液
思考：
如何将组织分散成单个细胞？
2. 制成细胞悬液
①说明动物细胞间的物质主要是什么成分？
蛋白质
三. 动物细胞培养的过程
不行。
思考：能不能用胃蛋白酶？
注意：
不能用胃蛋白酶将组织分散成单个细胞，因为胃蛋白酶的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活。
思考：胰蛋白酶可以将动物组织分散成单个细胞，使用时要注意什么问题呢？
注意：
动物细胞间的物质主要是蛋白质。使用胰蛋白酶时，应注意控制好作用时间。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，细胞膜也含有蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
胰蛋白酶能将细胞消化掉，应注意时间的控制。
(2)体外培养的动物细胞类型：
________体外培养的细胞需要_____________________才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的_____上，这种现象称为细胞贴壁。
取动物组织
(幼龄动物)
制成
细胞悬液
分散成单个细胞
(1)操作过程：将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养
原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，
即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
原代培养
培养
CO2
培养箱
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻
②贴壁生长类：
除受密度、有害代谢物、营养物质影响外，还会发生接触抑制现象
大多数
贴附于某些基质表面
瓶壁
3. 进行原代培养
三. 动物细胞培养的过程
培养瓶或培养皿要求：内表面光滑、无毒、易于贴附。
刚开始铺展贴壁生长
贴壁生长并进行有丝分裂
单层相互接触出现接触抑制
细胞的接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加
正常细胞
平面观
（2）癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。
肿瘤细胞
失去接触抑制
注意：
（1）正常细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，当细胞相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加，最后形成一层（或单层）。
正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。
癌细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，适宜条件下可以无限增殖。
思考：为什么癌变细胞没有接触抑制现象？
思考.进行传代培养(分瓶培养)时，如何处理？
悬浮细胞
贴壁细胞
离心法收集
胰蛋白酶处理
制成细胞悬液
分瓶培养
如何解决细胞接触抑制等原因导致的分裂受阻的问题呢？
分瓶培养，让细胞继续增殖
取动物组织
(幼龄动物)
4. 分瓶、传代培养
制成
细胞悬液
分散成单个细胞
原代培养
培养
CO2
培养箱
分瓶制成细胞悬液
传代培养
培养
(1)收集细胞
①悬浮生长类：
离心目的：在沉淀中得到细胞，同时去除上清液中的胰蛋白酶
②贴壁生长类：
重新用胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
(2)将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
直接用离心法收集
三. 动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
三、动物细胞培养的过程
思考：正常细胞能否一直传代培养下去？
传代培养
部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止
大部分细胞衰老死亡
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展
10~50代
继续培养（50代以后）
（有限细胞系）
（无限细胞系）
目前使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)；
这一阶段的细胞称为细胞株
细胞系的遗传物质一定改变了；
这一阶段的细胞称为细胞系
归纳总结：植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养过程
培养目的
相同点 获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
完整植株
植物激素
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
原代培养、传代培养
脱分化、再分化
（3）分布：
1.干细胞
（1）概念：
（4）分类：
电镜下的胚胎干细胞
存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
（2）特点：
体积较小，细胞核大，核仁明显。
03
四.干细胞培养及其应用
早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
在体外分化成心肌细胞、
神经元细胞和造血干细胞等
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
分布
特点
应用实例
局限性
胚胎干细胞
（ 简称ES细胞）
成体组织或器官内
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
成体干细胞
分布
特点
举例
造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
精原干细胞（睾丸中）
神经干细胞（神经系统中）
血细胞和免疫细胞
神经细胞
精原细胞
也叫全能干细胞
应用最成熟
（1）概念：
2.诱导多能干细胞（iPS细胞）
（2）获取方法：
（3）诱导多能干细胞优点：
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
病人
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
①将特定基因或特定蛋白导入细胞；②用小分子化合物诱导形成。
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
03
四.干细胞培养及其应用
技术不成熟
3.干细胞的应用
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
类型 应用
造血干细胞
神经干细胞
诱导多能干细胞（iPS细胞）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
干细胞应用面临的问题:存在着导致肿瘤发生的风险。
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四.干细胞培养及其应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
二、拓展应用
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
课堂小结

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