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(共52张PPT)
2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体
A细胞
B细胞
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
植物体细胞杂交技术
回顾旧知
运用植物体细胞杂交技术，可以打破生殖隔离，实现远缘杂交、培育出新的作物类型。
有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
回顾必修一：细胞膜的结构
1970年荧光标记的人-鼠细胞融合实验模式图
动物细胞可以像植物细胞一样实现杂种细胞融合，需要用到什么技术？
动物细胞融合技术
自主探究：阅读教材，完成下列问题：3min
1.动物细胞融合的概念
2.动物细胞融合的原理
3.诱导动物细胞融合的方法
4.动物细胞融合的意义
5.动物细胞融合的应用
01
动物细胞融合技术
1.概念：
使____或_____动物细胞结合形成____细胞的技术。
2.结果：
形成的________具有原来两个或多个细胞的_________。
3.原理：
与植物原生体融合的基本原理相同体现了 。
4.诱导融合的常用方法：
有 等。
一
两个
多个
一个
杂交细胞
遗传信息
细胞膜具有一定的流动性
电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法
是动物细胞融合特有的诱导融合方法
01
动物细胞融合技术
5.过程：
一
动物细胞融合
动物细胞培养
01
动物细胞融合技术
(原理 )
(原理： )
细胞膜的流动性
细胞增殖
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（诱导细胞融合）
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
相关信息
生物方法：灭活病毒诱导法
1、什么是病毒的灭活？
不灭活的病毒的可以用作细胞融合诱导剂吗？
不行，会感染细胞
01
动物细胞融合技术
相关信息
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
细胞核的融合
融合实质及完成的标志：
生物方法：灭活病毒诱导法
01
动物细胞融合技术
思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
肺结核病人病理切片
01
动物细胞融合技术
3.在动物细胞融合的实际操作过程中，是只用单个的两种细胞来融合吗？为什么？
不是，就目前常用的细胞融合方法来看，其融合效率都不可能是100%，仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞；因此通常将多个两种细胞放在一起进行融合：
01
动物细胞融合技术
01
动物细胞融合技术
4.以A、B细胞融合为例，若仅考虑细胞两立两两融合，融合后的杂交细胞类型有几种？
有A-A型、B-B型、A-B型，因此，为了 得到A-B型杂交细胞，我们需要通过一定的那个的方法把A-B型筛选出来，如用特定的选择培养基进行筛选，只有A-B型的杂交细胞能在该培养基上生长。
01
动物细胞融合技术
5.筛选后得到的A-B型杂交细胞的染色体数目是多少 染色体组数呢 (假设A细胞染色体数为2M,B细胞的染色体数是2N）
由于杂交细胞含有发生融合的两个细胞的遗传物质,因此得到的A-B型杂交细胞的染色体数为2M+2N；染色体组数为4个
6.植物体细胞杂交最终得到的是完整的植物个体,动物细胞融合后能发育成杂种动物个体吗
目前不能,只能得到杂交细胞
一
7.应用：
(1)细胞融合技术已经成为研究________、_________、______和______________等的重要手段
(2)利用动物细胞融合技术发展起来的_________，为__________ _开辟了新途径。
细胞遗传
细胞免疫
肿瘤
培育生物新品种
杂交瘤技术
制造单克隆抗体
01
动物细胞融合技术
6.意义：
突破了 的局限，使 成为可能。
有性杂交
远缘杂交
思考：假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用它来解决什么问题呢？
时间 成果
19世纪30年代 观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞
1858年 观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
1875年 第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
1876年 在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。
1962年 日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1965年 英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合
1974年 华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1975年 Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
20世纪80年代 发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合)
（一）补充资料：动物细胞融合技术的发展历史
动物细胞融合和植物体细胞杂交比较
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
抗体在新冠肺炎病毒治疗中的应用
一个捐献者的200-300毫升的血浆,如果合格,一般也只能治疗2-3个患者,
如何大量制备
1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？
2.抗体由什么细胞产生？
3.抗体的化学本质是什么？
4.与抗原作用的特点？
5.抗体主要分布在哪里？
主要分布在血清中。其次在组织液及外分泌液中也含有。
抗体是机体受抗原刺激后B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞产生
具有免疫功能的蛋白质
能与该抗原发生特异性结合
回顾旧知
抗体
体液免疫
思考：因此，传统上，我们获得抗体的方法是怎么样的呢？
（由于动物在生活中接触到的病原体很多，或者当注射的抗原不纯时，会导致产生的抗体多种多样，即抗体不纯，而抗体纯化技术繁琐、产量低、不利于大规模生产，且纯化效率难以达到100%）
传传统方法的缺陷： 产量低、纯度低，
抗体的特异性差、灵敏度低。
动物体内
1抗原
反复注射
02
单克隆抗体及其应用
获得抗体的传传统方法：
动物产生抗体
1
1
2
3
4
分离纯化抗体
资料：科学家发现：体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上，但每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体
单
克 隆
抗 体
一个
B淋巴细胞
大量、单一抗体
细胞群
克隆
启发：如何获得大量、单一的抗体？
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖（无法实现克隆）
需解决问题：
遗憾：
如何解决这一难题？
02
单克隆抗体及其应用
那么，如何解决传统方法制备的抗体产量低、纯度低，抗体的特异性差、灵敏度低的问题呢？
癌细胞
与癌细胞进行动物细胞融合
思考１：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的
思考２：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力
和无限增殖能力同时具备
思考：
02
单克隆抗体及其应用
一个极富创造力的方案：
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，
又能产生专一抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
02
单克隆抗体及其应用
二
(1)单克隆抗体的概念:
单个细胞
无性繁殖
化学性质单一，特异性强
单：
克隆：
抗体：
由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。
02
单克隆抗体及其应用
单克隆抗体制备的过程是怎么样的呢
依据图2-16制备单克隆抗体过程的示意图，思考以下问题：
1、初始的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞均有多个，融合后得到的细胞是否都是杂交瘤细胞？如何筛选？
2、诱导融合后得到的杂交瘤细胞，是否都能分泌所需的抗体？如何筛选
3、经筛选后得到的既能迅速、大量增殖，又能分泌所需抗体的数量有限，怎样获得大量的单克隆抗体？
02
单克隆抗体及其应用
用抗原注射小鼠
骨髓瘤细胞的培养
已免疫的多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
多种杂交细胞
小鼠的脾脏中获取
2、单克隆抗体的制备过程
02
单克隆抗体及其应用
用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
能产生抗体，
但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
融合的方法？融合后，融合细胞几种类型？（只考虑两两融合）
置于选择性培养基上培养
2
杂交瘤细胞
1
3
第一次筛选
多种杂交
瘤细胞
融合的细胞
骨髓瘤细胞
自身融合
B细胞自身融合
1
3
2
未融合的B淋巴细胞
未融合的骨髓瘤细胞
第一次筛选：
用特定的选择培养基（HAT培养基）进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
初始的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞均有多个，融合后得到的细胞是否都是杂交瘤细胞？如何筛选？
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选
(抗原-抗体杂交技术)
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
阳性细胞
第二次筛选：对选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
（抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞分泌的抗体能和特定的抗原结合）
用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞（每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞（充分稀释实现））
克隆化培养：指单个细胞分裂增殖获得细胞团的培养过程
为什么要进行克隆化培养？
（1）获得单一杂交瘤细胞
（2）使单一抗体浓度增大
诱导融合后得到的杂交瘤细胞，是否都能分泌所需的抗体？如何筛选
注射到小鼠体内
体外培养
分离、提纯单克隆抗体
体内或体外培养
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外大规模培养或者注射小鼠腹腔中增值
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体
(1)能准确地识别抗原的细微差异;
与特定抗原发生特异性结合;
(2)可以大量制备。
获得的单克隆抗体有什么优点？
经筛选后得到的既能迅速、大量增殖，又能分泌所需抗体的数量有限，怎样获得大量的单克隆抗体？
骨髓瘤细胞培养
杂交细胞
单一抗体
阳性细胞
单克隆
抗体
细胞融合
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
融合
筛
选
克
隆化培养
抗体检测 · 筛选
脾脏中获取
2、单克隆抗体的制备过程总览
【两次筛选的比较】
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选原因
筛选方法
筛选结果
诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞等。
用特定的选择培养基筛选只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
得到杂交瘤细胞
小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，杂交瘤细胞中有产生其他抗体的细胞
用96孔板进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选
得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
【培养杂交瘤细胞的方法比较】
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
对于单克隆抗体制备技术，大家还有没有什么疑问？
疑问1：为什么用骨髓瘤细胞，不用别的癌细胞？
疑问2：产生抗体的是浆细胞，为什么用来细胞融合的是B淋巴细胞而不是浆细胞？
骨髓瘤又称浆细胞瘤，起源于骨髓中浆细胞的恶性肿瘤，骨髓瘤细胞是基因缺陷细胞，无法在特定选择培养基上生长，只有融合成功的杂交瘤细胞（含有B淋巴细胞的基因，弥补缺陷）才能在特定选择培养基上生长，便于筛选杂交瘤细胞。
哺乳动物B细胞的发育过程:祖B细胞→前B细胞→未成熟B细胞→成熟B细胞→活化B细胞→浆细胞。
用于单抗制备的是成熟B细胞还是浆细胞呢 两者都不是。
成熟B细胞未接受抗原刺激,不能产生抗体,但是浆细胞也不适用于细胞融合。有研究证实,小鼠注射抗原后7~8d抗体达到高峰,也就是7~8d后浆细胞达到高峰,但是取此时的细胞和骨髓瘤细胞融合效率很低。若取免疫后3d的细胞,则融合的效率最高。而此时的B细胞正处于从成熟B细胞向浆细胞分化的时期,也就是活化B细胞时期。所以用于细胞融合的是接受过抗原刺激的活化B细胞。
选讲
←B淋巴细胞及同型融合细胞
←骨髓瘤细胞及同型融合细胞
←杂交瘤细胞
补充资料：如何进行第一次筛选获得多种杂交瘤细胞？
①已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径（基因缺陷），但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
不能无限增殖，死亡
不能无限增殖，死亡
能无限增殖，生长
培养基中加入氨基嘌呤
HAT培养基
我们需要筛选的目的细胞，既B细胞和瘤细胞的融合细胞，但在细胞融合的过程中除了B细胞与瘤细胞能融合外，B细胞自身、瘤细胞自身也都能发生融合，另外还有多个B细胞与多个瘤细胞融合的情况（这种细胞不稳定，几乎不能存活)以及未融合的细胞。B细胞和B细胞的自身融合细胞，其仍然不能无限增殖，在体外增殖数代后就会死亡，不足为虑，主要的问题是如何消灭未融合和自身融合的瘤细胞。
补充资料：HAT培养基筛选杂交瘤细胞原理
选讲
为了更好地理解HAT培养基的筛选原理，需要了解核酸合成的途径，如下图：
补充资料：HAT培养基筛选杂交瘤细胞原理
选讲
既然体内有两条核酸合成途径，那么就可以利用其中一条来进行筛选了，看图：
补充资料：HAT培养基筛选杂交瘤细胞原理
选讲
在选择培养基中添加某些物质来阻断核酸的主要途径，那么未融合的瘤细胞和瘤细胞自身融合的细胞在筛选过程中就会死去，能存活下来的就只有能进行旁路途径合成核酸的B细胞和瘤细胞的融合细胞了。
A—氨基蝶呤为叶酸的结构类似物，正是它阻断了核酸合成的主要途径，阻碍了次黄嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸的合成。H—次黄嘌呤，可经核酸合成旁路途径合成次黄嘌呤核苷酸，从而完成嘌呤核苷酸的补救合成。T—胸腺嘧啶核苷酸，直接添加到培养基中来补足被阻断的嘧啶核苷酸的合成。即HAT培养基。
补充资料：HAT培养基筛选杂交瘤细胞原理
选讲
补充资料：HAT培养基筛选杂交瘤细胞原理
选讲
补充资料：如何进行第二次筛选获得能分泌所所需抗体的杂交瘤细胞？
将杂交瘤细胞群稀释后滴入多孔板，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）
一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
多孔细胞培养板
阳性孔
抗体检测板
多次克隆化培养以及有限稀释法
抗原-抗体杂交(分子水平的鉴定）
抗体检测原理：
(抗原-抗体特异性结合）
补充了解——克隆化培养和抗体检测
★
有限稀释法
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
选讲
补充了解——不同水平的克隆及实例
分子水平
细胞水平
个体水平
DNA复制、PCR技术
动物细胞培养
植物组织培养、动物细胞核移植
细胞水平
单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？
思考
单克隆抗体
筛选二
杂交细胞
杂交瘤细胞
体外或
体内培养
筛选一
骨髓瘤
细胞
诱导融合
分泌特异抗体
的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞群
提取
已免疫的
B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
单克隆抗体的制备
既能大量繁殖
又能产生专一抗体
特异性强
灵敏度高
可大量制备
注射
抗原
小结
(1)应用到的技术：
(2)原理：
(3)优点：
细胞膜的流动性、细胞增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
02
单克隆抗体及其应用
①单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合
②可以大量制备
单克隆抗体有哪些方面的应用呢？
女性怀孕后会分泌一种糖蛋白——人绒毛膜促性腺激素（HCG），尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。
3.单克隆抗体的应用
(1)作诊断试剂——应用最广泛
实例：利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
二
抗原-抗体杂交法
优点：准确、高效、简易、快速。
结合同位素的单抗
荧光标记的单抗
02
单克隆抗体及其应用
(2)运载药物
二
抗体-药物偶联物（ADC）通过将 与能特异性识别肿瘤抗原的 结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由_____、______和______三部分组成。
单克隆抗体
细胞毒素
抗体
接头
药物
“生物导弹”
=单克隆抗体＋放射性同位素
或＋化学药物
或＋细胞毒素
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单抗导向，药物为弹头
靶向运输作用
3.单克隆抗体的应用
02
单克隆抗体及其应用
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
讨论：
抗体：主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞
药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
2. 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长。
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
(3)作为药物治疗疾病
二
单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病
02
单克隆抗体及其应用
3.单克隆抗体的应用
一、概念检测
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
练习与应用
C
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
练习与应用
A
练习与应用
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。

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