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(共53张PPT)
3.1 重组DNA技术的基本工具
中国棉花
1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾;
国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。
棉花棉铃虫幼虫
中国棉花
1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种--中棉所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%;
2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种--中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性。
我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家。
基因工程
操作环境及操作对象
原理
操作水平
结果
体外环境；基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程
一
二
三
DNA双螺旋结构是谁建立的？
证明DNA是半保留复制的科学家是谁？
第一个基因工程药物是什么？
阅读课本68页-69页，回答下列的问题
让我们一起来看看基因工程的诞生和发展吧~
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒DNA双螺旋的直径只有2 nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些 “分子工具”各具有什么特征呢？
环斑病毒的
非转基因木瓜
转基因木瓜
培育转基因番木瓜的方法
抗番木瓜环斑病毒基因提取
抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接
抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞
“分子运输车”
“分子手术刀”
“分子缝合针”
培育转基因番木瓜的工具
限制性核酸内切酶--“分子手术刀”
1
主要是原核生物
来源
1、识别双链DNA分子
作用
形成黏性末端或平末端
结果
2、断开磷酸二酯键
磷酸二酯键
切点
？
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
限制性核酸内切酶--“分子手术刀”
1
G
G
A
T
C
A
T
C
A
T
A
T
大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别
_________序列，并切割___和___之间的____________。
切割后产生__________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
EcoRI 限制酶
限制酶
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
限制性核酸内切酶--“分子手术刀”
1
SmaI 限制酶只能识别 序列，切割 和 之
间的 切开，切割后产生 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
平末端
SmaI 限制酶
限制酶
限制性核酸内切酶--“分子手术刀”
1
1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？P71
破坏外源DNA，保护自我
2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ P74二、1
缺乏特定的核苷酸序列
反向对称重复排列
G
G
A
T
C
A
T
C
A
T
A
T
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
或甲基化保护特定的核苷酸序列
DNA连接酶--“分子缝合针”
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将 和 连接起来催化形成 。
脱氧核糖
磷酸
磷酸二酯键
2
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来；
E.coliDNA连接酶
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。
T
C
G
A
T
C
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！
T4 DNA连接酶
还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
类型
来源
功能
相同点
差别
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和
平末端(效率较低)
【小结】E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶的区别
DNA连接酶--“分子缝合针”
2
DNA连接酶
DNA连接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
连接两个DNA片段
DNA连接酶作用示意图：
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA聚合酶作用示意图：
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
【小结】DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA聚合酶
DNA连接酶
DNA解旋酶
限制酶
下列是有关DNA的各种酶，请选择对应的作用位点：
氢键
磷酸二酯键
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
目的基因怎样才能成功进入受体细胞？
基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”
3
载体的作用
载体的
必要条件
载体的种类
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
②具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。
④必须是安全的 ，对受体细胞无害。
①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①细菌、真菌的质粒
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
【阅读课本第72页相关内容，填写下表：】
基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”
3
3
基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”
质粒
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。
能复制并带着插入的目的基因一起复制
一种较为理想的载体，它是独立于细菌拟核之外的很小的双链环状DNA分子，具有自我复制能力。有一个至多个限制酶切割位点，并含有一些抗生素抗性基因（如图）,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，这些基因可以作为鉴定和筛选重组DNA的标记基因。
重组DNA分子
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。
质粒 粘成环状
供体DNA
有义链
①
②
③
④
有义链
哪个相当于质粒，哪个相当于供体DNA？
目的基因
载体
目的基因
载体
有义链
有义链
有义链
有义链
有义链
有义链
反向连接，目的基因不能表达
目的基因+载体
载体自身头尾相连（自身环化）
目的基因自身环化
EcoRI
-GAATTC-
-CTTAAG-
BamHI
-GGATCC-
-CCTAGG-
用两种不同的限制酶来剪切同一DNA分子
……ATAGGATCCTATCCATGAATTCGGCATAC……
……TATCCTAGGATAGGTACTTAAGCCGTATG……
AATTCGGCATAC……
GCCGTATG……
GATCCTATCCATG
GATAGGTACTTAA
……ATAG
……TATCCTAG
质粒 粘成环状
供体DNA
EcoRI
-GAATTC-
-CTTAAG-
BamHI
-GGATCC-
-CCTAGG-
用两种不同的限制酶来剪切同一DNA分子
G A T C CTATCCATG
G ATAGGTACTTAA
质粒 粘成环状
供体DNA
有义链
有义链
有义链
有义链
目的基因+目的基因
载体+载体
一种限制酶切割后产生的黏性末端相同，相同的黏性末端之间可以任意连接。
原因：
重组DNA分子
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
质粒 粘成环状
供体DNA
有义链
①
②
③
④
有义链
重组DNA分子
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。
根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
质粒 粘成环状
供体DNA
重组DNA分子
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
质粒 粘成环状
供体DNA
在基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是 ,限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是 。根据下图判断,下列操作正确的是(　　)
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.质粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割
D
2.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ和BamH I三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示，请回答下列问题：
⑴ 将含有目的基因的DNA与质粒分别用Sal I酶切，酶切产物用_ _______ 催化连接后，两个DNA片段的连接结果有_________种。
⑵ 构建重组质粒时，应选用__________________两种酶对 ___ ________
进行切割，目的是__________________
DNA连接酶
3
SalⅠ和HindⅢ
载体和含目的基因的DNA
阻止目的基因与载体的自身环化和反向连接
1.提取DNA的方法
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（1）提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子
（2）提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
【实验：DNA的粗提取与鉴定】
P74
【实验：DNA的粗提取与鉴定】
2.实验原理
（1）DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
（2）在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高
（3）DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
3、材料用具
DNA的粗提取与鉴定
（1）选材
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
3、材料用具
DNA的粗提取与鉴定
（2）试剂
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
—洗 涤剂
SDS:使蛋白质变性与DNA分离;
EDTA:是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;
Tris:提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。
【实验：DNA的粗提取与鉴定】
4.实验步骤
(1)称取约30g洋葱,切碎,然后放入研中,倒入10mL研磨液,充分研磨。
(2)在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯中,在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量
过滤能用滤纸代替吗？
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。
4.实验步骤
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
（1）冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用：
一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
避免破坏DNA
【实验：DNA的粗提取与鉴定】
这一步的目的是蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
(4)取两支20mL的试管,各加入2mol/L的NaC1溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaC1溶液中。然后,向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化。
4.实验步骤
【实验：DNA的粗提取与鉴定】
【请同学们补充完整以下实验步骤】
试管编号 A（对照组） B（实验组）
步骤1 2mol/L的NaC1溶液5mL 步骤2 不进行任何处理
步骤3 步骤4 沸水浴加热5min 实验现象 溶液不变蓝色
实验结论 加丝状物或沉淀物
加4mL的二苯胺试剂
溶液逐渐变蓝
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色
【实验：DNA的粗提取与鉴定】
5.结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
【实验：DNA的粗提取与鉴定】
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。
从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。
5.结果分析与评价
【进一步探究】
本试验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液（体积比为24:1），通过离心将蛋白质及其它杂质除去，取清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的粘稠液体。此外，由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将二者分开。
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
练习与应用
C
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A. 大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
练习与应用
A
练习与应用
二、拓展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用
二、拓展应用
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
练习与应用
二、拓展应用
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。

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