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第二章
细胞工程
科技探索之路
细胞工程的发展历程
1902年，哈伯兰特(G.Haberlandt，1854一1945)提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
1958年，斯图尔德(EC.Steward，1904一1993)等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960年，科金(E.C.Cocking，1931一）用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1964年，古哈(S.Guha，1938-2007)等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1971年，卡尔森（PS.Carlson，1944一2017)诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1974年，土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术紧密结合。
植物细胞工程
动物细胞工程（含胚胎工程）
1890年，希普(W.Heape，1855-1929）将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。
1907年，哈里森（R.G.Harrison，1870一1959)用一滴淋巴液成功地培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
1951年，张明觉(1908-1991)）等发现了哺乳动物精子的获能现象。
1958年，格登(J.Gurdon，1933一)用非州爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体。同一时期，我国科学家童第周(1902一1979)等开展了鱼类细胞核移植工作
1959年，试管家免诞生。之后，多种试管动物相继出生。
1975年，米尔斯坦(C.Milstein，1927一2002)和科勒(G.K6hler，1946一1995)等创立了单克隆抗体技术。
1978年，小鼠的桑葚胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。
1981年，埃文斯(M.Evans，1941一)等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞。
1996年，世界上第一只体细胞克隆羊多利在英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。
2006年，山中伸弥(S.Yamanaka，1962一)等获得了诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育出了小鼠。
2014年，世界上第一例经单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
2017年，我国科学家首次培育了体细跑克隆猴。
第二章
细胞工程
2.1.1 植物细胞工程的基本技术
植物通常是通过播种或扦插实现繁殖的。
玉米种子萌发
黄豆种子发芽
落地生根
一、植物细胞工程的基本技术
1.细胞的全能性：2.原因：每一个细胞含有控制该生物发育的全部基因3.比较：（1）受精卵＞胚胎干细胞＞生殖细胞＞体细胞（2）植物细胞＞动物细胞4.物体内细胞并不都表现全能性的原因在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性表达细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能一、植物细胞工程的基本技术思考：
1.是不是所有的活细胞都具有全能性？
2.种子发育成植株体现了全能性了吗？
3.细胞具有的全能性一定能表现出来吗？
不是；
例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。
没有；
植物种子种的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，没有体现出细胞具有发育成完整植株的潜能。
不一定；
例如动物的体细胞。
——如何才能让细胞表现出全能性？
一、植物细胞工程的基本技术
02.植物组织培养技术5.表现出全能性的条件：①、离体②、一定的营养物质、植物激素③、适宜的温度、pH等外界条件④、无菌环境——如何才能让细胞表现出全能性？1958年Steward利用胡萝卜韧皮部诱导分化产生了胚状体，这是人类第一次获得了人工胚状体，并获得个体植株。
从社会中来
国画作品—兰
如何能让名贵的兰花大量、快速繁殖呢？
植物组织培养
1.概念：指的植物器官、组织或细胞等，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其分化为的技术。离体完整植株外植体2.原理：植物细胞的全能性3.生殖方式：无性生殖4.分裂方式：有丝分裂一、植物组织培养技术自主阅读教材35页—37页，小组思考并讨论以下问题：1.概述植物组织培养的基本过程？2.什么是脱分化 再分化 愈伤组织？3.请从条件、关键因素、产物等方面比较脱分化和再分化异同。4.在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？一、植物组织培养技术脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞。再分化：愈伤组织继续进行培养，又重新分化成根或芽等器官的过程。细胞排列疏松且无规则，高度液泡化，无定形状态的薄壁细胞团。外植体：用于植物组织培养的离体植物器官、组织或细胞。愈伤组织：接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽诱导生根脱分化再分化移栽成活植物组织培养过程：再分化生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。它们的浓度、比例都会影响植物细胞的发育方向。决定植物脱分化、再分化的关键因素：生长素用量/细胞分裂素用量结果比值≈1比值＞1比值＜1促进愈伤组织的形成促进根的分化促进芽的分化巧记：高根低芽中愈伤细胞分裂素生长素芽分化愈伤组织根分化一、植物组织培养技术1.目的：
（1）了解植物组织培养的基本原理
（2）了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例对菊花愈伤组织形成和分化的影响
（3）尝试进行植物组织培养
2.材料：
离体的茎尖、根尖、叶片、花药等（外植体）。
3.MS培养基：
水（去离子水）、无机营养（大量元素、微量元素）、有机营养（蔗糖、维生素、氨基酸）、天然附加物、植物激素（生长素、细胞分裂素等）
探究-实践：菊花的组织培养
4.步骤：制备外植体接种培养试管苗移栽消毒：切割：（无菌操作）酒精30S无菌水2-3次次氯酸钠溶液30min材料：幼嫩的菊花茎段2-3次无菌水洗消毒与无菌水冲洗切割与接种探究-实践：菊花的组织培养思考：为什么整个过程要保证无菌操作？避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。制备外植体接种培养试管苗移栽①接种到诱导愈伤组织培养基形成愈伤组织培养温度：18-220C、避光愈伤组织有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。探究-实践：菊花的组织培养4.步骤：接种时应将菊花茎段形态学下端插入培养基，不能倒插制备外植体接种培养试管苗移栽探究-实践：菊花的组织培养4.步骤：②接种到诱导生芽培养基，一定光照诱导生芽制备外植体
接种培养
试管苗移栽
探究-实践：菊花的组织培养
4.步骤：
③接种到诱导生根培养基，一定光照
诱导生根
思考：整个过程中使用的培养基中，生长素/细胞分裂素的比值大小是如何变化的？
比值适中→比值低→比值高
制备外植体
接种培养
试管苗移栽
探究-实践：菊花的组织培养
4.步骤：
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将 幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情 况，适时浇水、施肥，直至开花。
5.结果分析与评价用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。导致外植体被污染的原因可能有：培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等。探究-实践：菊花的组织培养（1）接种3～4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因。5.结果分析与评价观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出了愈伤组织。从刚接种的外植体到长出愈伤组织一般需要2周左右的时间。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成芽和根的比例和时间。探究-实践：菊花的组织培养（2）你培养出愈伤组织了吗？如果培养出来了，从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历了多少天？这些愈伤组织进一步分化出芽和根了吗？5.结果分析与评价生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。探究-实践：菊花的组织培养（3）你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？进一步分化出芽和根了吗？C
练习
1、植物组织培养可以形成愈伤组织，下列有关愈伤组织的叙述错误的是
A.愈伤组织是离体细胞经过脱分化形成的
B.形成愈伤组织的培养基不含有机分子
C.愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构
D.愈伤组织细胞的线粒体和核糖体中可能发生碱基互补配对
2、关于植物组织培养的再分化过程，说法错误的是
A.再分化过程中，不同细胞内合成了功能不同的特异性蛋白质
B.脱分化与再分化过程所使用的培养基主要是激素浓度及用量比例的不同
C.再分化过程在实验室或植物组织培养车间进行，需要避光处理
D.再分化过程中，核遗传物质没有发生改变，但mRNA有变化
B
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你会有什么办法呢？
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能。因为不同种生物之间存在着生殖隔离
三、植物体细胞杂交技术
思考：番茄和马铃薯的体细胞杂交时，首先遇到的障碍是什么？用什么方法可以解除这一障碍？
细胞壁会阻碍植物细胞之间的融合。由于细胞壁主要由纤维素和果胶构成，所以可以用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得有生命活力的原生质体。
注意：原生质体虽然没有细胞壁，但是具有活细胞的一切特征。酶解法获得原生质体条件温和，原生质体完整性好，活力高。
原生质体
纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？
使溶液有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破
三、植物体细胞杂交技术
过程
A细胞
B细胞
纤维素酶果胶酶
去壁：
酶解法
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
诱融
物理法：
化学法：
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+ —高pH融合法等
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
三、植物体细胞杂交技术
融合的原生质体重新产生细胞壁，形成杂种细胞
思考：1、参与此过程中的主要细胞器是？
2、杂种细胞的染色体数是多少？
3、杂种细胞染色体组数是多少？
4、融合后，培养基中有几种类型的细胞？
验证再生出新壁的实验：
质壁分离和质壁分离复原实验
细胞融合完成的标志：
高尔基体
两亲本染色体数之和
两亲本染色体组数之和
①未融合的细胞：A、B ②两两融合的细胞：AA、BB、AB ③多细胞融合体
需要进一步筛选
三、植物体细胞杂交技术
概念：
将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
原理：
体细胞杂交利用了细胞膜具有一定的流动性。
杂种细胞培育成植株利用了植物细胞的全能性。
三、植物体细胞杂交技术
+
=
白菜
甘蓝
白菜-甘蓝
1.白菜（2N=18）与甘蓝（2N=18）体细胞杂交所得植株
白菜-甘蓝的细胞染色体数为 ，属于 倍体。
36
（异源）四
2.白菜（2N=18）与甘蓝（2N=18）进行杂交（相互授粉），
所得植株白菜-甘蓝的细胞染色体数为 ，属于 倍体。
（异源）二
18
基因重组
染色体数目变异
三、植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交育种
四倍体
有性杂交育种
四倍体
二倍体
如何判断植株是否可育？
看减数分裂联会、配对能否正常进行！
①若亲本植株可育，
则杂种植株可育。
②杂种植株是不同于
亲本的新物种。
优点：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
研究现状
仍有许多理论与技术问题没有解决，还不能让杂种植株表现出人们所需要的所有性状
三、植物体细胞杂交技术
拓展延伸
植物组织培养 植物体细胞杂交技术
原理
过程
注意事项
细胞膜的流动性和植物细胞的全能性
植物细胞的全能性
离体的植物器官、组织或细胞
愈伤组织
脱分化
再分化
根、芽或胚状体
植物体
生长发育
植物组织培养与植物体细胞杂交技术的比较
植物细胞A
植物细胞B
原生质体A
去壁
原生质体B
去壁
人工诱导
融合的原生质体AB
杂种细胞AB
愈伤组织
脱分化
再生细胞壁
杂种植株
再分化
①选材：选取幼嫩的茎段，此部分容易诱导形成愈伤组织。
②光照：诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。
①与动物细胞融合相比，植物细胞首先要去除细胞壁变为原生质体，可以用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。
②只有处理时间得当，细胞壁去除了才能提高成活率
2、科学家利用植物体细胞杂交技术将番茄与马铃薯的体细胞原生质体融合，最终得到番茄—马铃薯杂种植株。下列有关叙述错误的是
A.番茄—马铃薯杂种植株能在地上结番茄、地下长马铃薯
B.可用物理法使番茄的原生质体和马铃薯的原生质体融合
C.该项生物工程技术可克服生物远缘杂交不亲和的障碍
D.该项生物工程技术需经历脱分化和再分化
A
练习
1、下列关于植物体细胞杂交技术的叙述中，不正确的是
A.利用植物体细胞杂交可以获得多倍体植株
B.植物体细胞杂交技术就是原生质体融合过程
C.可根据质壁分离现象鉴别杂种细胞的细胞壁是否再生
D.可根据细胞中染色体数目和形态的差异鉴定杂种细胞
B
3、驱蚊草含有香茅醛，能散发出一种特殊的柠檬型香气，从而达到驱蚊且对人体无害的效果。它是把天竺葵的原生质体和香茅草的原生质体进行诱导融合培育而成的。下列关于驱蚊草培育的叙述，错误的是
A.驱蚊草的培育属于细胞工程育种
B.相比于杂交育种，这种育种方法的优点是克服了远缘杂交不亲和的障碍
C.驱蚊草培育利用了植物体细胞杂交技术，育种原理是染色体数目变异
D.融合的细胞具有全能性，因此不需要植物组织培养就可得到杂种植株
D
练习
4、如图为白菜—甘蓝杂种植株的培育过程。正确的是
A.图示白菜—甘蓝植株不能结籽
B.愈伤组织的代谢类型是自养需氧型
C.上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂
D.白菜—甘蓝杂种植株具有的性状是基因选择性表达的结果
D
练习
5、识图：数字代表过程，字母代表细胞、组织或植株
①_______________ a/b_____________
②_______________ c_______________
③_______________ d_______________
④_______________ e_______________
⑤_______________ f_______________
①②③___________ ④⑤____________
去除细胞壁
原生质体
原生质体间的融合
正在融合的原生质体
再生出新的细胞壁
杂种细胞
脱分化
愈伤组织
再分化
杂种植株
植物细胞融合
植物组织培养
练习
10、图为植物体细胞杂交过程示意图。据图回答：
（1）步骤①是 ，最常用的方法是 。
（2）步骤②一般常用的化学试剂是 ，目的是 。　　
(3)在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，此技术运用的原理是 ，其中步骤④相当于 ，步骤⑤相当于 。
（4）植物体细胞杂交的目的是获得新的杂种植株，
使　　　　　 能够在新的植物体上有所表现，其根本原因是　　　　　　　 。
（5）若远缘杂交亲本A的基因型为AaBb，B的基因型为YYEe，则融合后形成的杂种植株基因型是 。
去除细胞壁，分离原生质体
酶解法
聚乙二醇（PEG）
诱导植物原生质体融合
脱分化
再分化
远缘杂交亲本的遗传特征
杂种植株获得双亲的遗传物质
细胞的全能性
AaBbYYEe
练习
（6）从理论上讲，杂种植株的育性　　。若运用传统有性杂交方法能否实现？　　　；原因是　　　 。因此，这项研究对于培养作物新品种方面的重大意义在于　　　　　　　　　　　 。
（7）利用植物体细胞杂交的方法培育作物新品种过程中，遗传物质的传递是否遵循孟德尔的遗传规律？为什么？
可育
不能
不同种生物之间存在生殖隔离
不遵循；因为孟德尔遗传规律发生在有性生殖减数分裂产生配子时，而植物体细胞杂交育种属于无性生殖。
克服了远缘杂交不亲和的障碍
练习
10、图为植物体细胞杂交过程示意图。据图回答：
课堂小结
概念
植物细胞融合
原生质体制备
过程
变异类型
植物组织培养
原生质体融合
原理
育种类型
原理
过程
花药离体培养
细胞全能性
操作步骤
脱分化
再分化
外植体
根、芽、胚状体
愈伤组织
外植体消毒
接种
切块
形成愈伤组织
诱导生芽生根
植物体细胞杂交
植物组织培养
植物细胞工程
优缺点
思考：据报道，某男子培育出一株奇怪的植株，实现了“地上长番
茄、地下结马铃薯”，你认为该男子可能是利用什么方法获
得的该植株？
分析：__________________________________________。
接穗
砧木
嫁接。以土豆植株为砧木，以番茄植株为接穗

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