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第3章基因工程工程第2节基因工程的基本操作程序（第1课时）目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建1简述PCR的原理、条件及过程(重点)。2简述基因表达载体的组成及构建过程(重、难点)。1.目的基因的筛选与获取4.目的基因的检测与鉴定2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序目的基因概念在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。实例与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因第一步目的基因的筛选与获取1.(2023·山西太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是A.目的基因就是编码蛋白质的基因B.获取目的基因是基因工程的第一步C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会√目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。培育转基因抗虫棉的简要过程普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入与载体拼接重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定Bt基因苏云金杆菌当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。【相关信息】P77①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响（一）筛选合适目的基因：1.较为有效的方法之一从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2.认识基因结构和功能的技术方法测序技术序列数据库序列比对工具获取目的基因的方法1.人工合成目的基因。2.通过构建基因文库来获取目的基因。3.常用PCR特异性地快速扩增目的基因。抗虫基因快速获得大量抗虫基因苏云金杆菌提取PCR由穆里斯等人于1985年发明，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。（三）利用PCR获取和扩增目的基因：1.发明者DNA半保留复制原理体外操作环境对目的基因的核苷酸序列进行大量复制目的短时间内大量扩增目的基因优点聚合酶链式反应全称PCR在一定的缓冲溶液中进行，一般要添加Mg2＋。DNA聚合酶需要Mg2＋激活【重温】DNA复制的过程1.解旋2.合成子链3.形成新DNAATP3′5′为什么子链的延伸方向是5 ′→3 ′？DNA聚合酶3′5′模板链子链因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链，只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端为什么子链合成需要引物？引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端PCR扩增仪DNA分子电泳仪器一定量的模板DNA引物4中脱氧核苷酸dNTP缓冲液热稳定DNA聚合酶（Taq酶）Mg2+作为DNA复制的模板使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料提供相对稳定的pH环境催化合成DNA子链真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活DNA复制所需的基本条件ATP与dATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_______以上时，断裂，双链DNA解聚为两条。氢键单链DNA待扩增的DNA片段第一步：变性3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。PCR反应的过程2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过与两条单链DNA结合。第二步：复性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对5’5’思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶(DNA聚合酶)不能从头合成DNA。②引物结合在DNA模板链3'端位置，Taq酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链。3’3’3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端目的基因的筛选与获取第一轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。PCR反应的结果5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’【问题探究】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？三次循环（1）要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2（2）设计引物的依据是？已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。第二轮循环的产物第三轮的产物3’5’3’5’3’5’3’5’第一轮循环的产物3’5’3’5’01目的基因的筛选与获取2个引物6个引物14个引物（3）如果循环n次，则共需消耗个引物。则共需消耗对引物。复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－62n－2nPCR中的数量关系（1）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应（　　）（2）PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚（　　）（3）PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温（　　）（4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高（　　）判断常考语句，澄清易混易错目的基因的筛选与获取2.下列有关PCR技术的说法，错误的是A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B.PCR技术的原理是DNA半保留复制C.PCR的特异性主要取决于引物的碱基序列特异性D.PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA√解析　引物的碱基序列特异性决定了PCR的特异性，C正确；PCR扩增中双链DNA受热变性后解聚为单链，不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。用PCR可以扩增mRNA吗？P79mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。产物进行鉴定琼脂糖凝胶电泳DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。PCR技术DNA复制相同点原则原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子1.PCR是聚合酶链式反应的缩写，该技术的原理是DNA半保留复制。2.PCR反应进行的条件有缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、温度条件等。3.PCR扩增的过程：变性→复性→延伸。问题:获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解不能原因那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？1.构建基因表达载体的目的：2.基因表达载体的组成（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。e复制原点基因表达载体的构建人们所需要的基因作用：便于重组DNA分子的筛选位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片断）终止转录位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）DNA复制的起始位点启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。请结合下图，回答问题：质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。启动子终止子起始密码子终止密码子【区分两组概念】位于基因上位于mRNA上翻译的起始点翻译的终点转录的起始点转录的终点(本身不转录)决定氨基酸AUG(甲硫氨酸）GUG（缬氨酸）不决定氨基酸（UAA、UGA、UAG)同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割DNA连接酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因限制酶切割位点质粒重组DNA分子限制酶限制酶思考：那如何将目的基因和表达载体连接？使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接 反向连接11’22’122’1’22’1’1单酶切缺点：①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接双酶切（产生不同的黏性末端）如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。不破坏目的基因原则：①保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：②图解限制酶的选择原则图解限制酶的选择原则通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接）可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。确保出现相同黏性末端原则：③

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