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(共47张PPT)
2.2 动物细胞工程
动物细胞培养
1、动物细胞工程常用技术有哪些？基础技术是？
2、动物细胞培养的定义、原理、培养对象、目的？
3、动物细胞培养的条件？
如何维持无菌、无毒环境？
适宜的温度和pH分别是多少？渗透压的影响因素？
适宜的气体环境包括？分别有什么作用？如何维持？
4、动物细胞培养流程？体外培养动物细胞的种类？
5、细胞贴壁、接触抑制、原代培养、传代培养的定义
6、动植物细胞培养的区别（原理、培养基种类、培养基特有成分、培养结果、细胞来源、特点）和相同之处
7、干细胞的定义、种类、应用
动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
定义：
细胞增殖
原理：
胚胎或幼龄动物细胞
培养对象：
获得细胞或细胞产物
目的：
一、动物细胞培养的条件
营养条件
其他条件
动物细胞培养
所需的基本条件
＜
＞
糖类、氨基酸、无机盐、维生素……
无菌、无毒的环境
适宜温度、pH、渗透压
适宜的气体环境
1、营 养
合成培养基：将细胞所需营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，加入血清等一些天然成分。
培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
▲培养皿
▲培养瓶
2、无菌、无毒的环境
需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。
培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
▲超净工作台
▲酒精灯火焰附近
3、温度、pH和渗透压
温度：( 36.5±0.5 )℃
pH：7.2 ~ 7.4
4、气体环境
O2是细胞代谢所必需的
CO2的主要作用是维持培养液的pH。
通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
二. 动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液
原代培养
转入
CO2培养箱
机械法
酶解法：
胰蛋白酶和胶原蛋白酶
动物组织经过处理后的初次培养
转入
分瓶
传代培养
动物组织经过分瓶后的培养
CO2培养箱
贴壁细胞的收集：
悬浮培养细胞的收集：
离心法
胰蛋白酶等处理后离心
可以用胃蛋白酶在体外分散细胞吗？
不可以；胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2 ~ 7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。
▲ 贴壁生长示意图
▲ 接触抑制示意图
培养瓶壁
1、能够悬浮在培养液中生长增殖的细胞
2、细胞贴壁的细胞
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖（接触抑制）
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
体外培养的动物细胞可以分为哪两类？
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基类型
培养基特有成分
培养结果
细胞来源
特点
相同点
植物细胞的全能性
细胞增殖
液体培养基，合成培养基
固体培养基，天然培养基
植物激素、有机添加物（蔗糖）
血清、葡萄糖等
新个体或大量细胞或细胞产品
细胞或细胞产品
离体的植物器官、组织或细胞
胚胎或幼龄动物组织
1、分裂形成愈伤组织
2、分化形成胚状体
1、只分裂不分化
2、贴壁生长，接触抑制
无菌操作、适宜的环境、只进行有丝分裂
三. 干细胞培养及应用
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞
1. 概念
2. 分布
早期胚胎
骨髓
脐带血
3. 分类：
发育阶段分：
胚胎干细胞（ES干细胞）和成体干细胞
成体干细胞：
位于成体组织或器官内的干细胞。如造血干细胞、神经干细胞、精原干细胞等。
红细胞
血小板
各类白细胞
造血干细胞
成体干细胞具有组织特异性，只能在特定的组织中分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
分化潜能分：
全能干细胞：胚胎干细胞
多能干细胞：脐带干细胞、胎盘干细胞
专能干细胞：神经干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞
诱导多能干细胞（iPS细胞）——
类似于胚胎干细胞的一种细胞
iPS细胞
多种体细胞
定向诱导分化
体外诱导人的成纤维细胞
白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
治疗
诱导过程无须破坏胚胎，而且iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，
定向诱导分化
4. 应用：
通过造血干细胞的移植可以治疗白血病、遗传性血液病（如地中海贫血、血液再生障碍性贫血、镰刀状细胞贫血）等疾病。
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。
自体移植
科学家正在研究用胚胎干细胞治疗神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）、糖尿病、心肌坏死等疾病。
动物细胞融合技术与单克隆抗体
抗体
本质：
分布：
具有免疫功能的球蛋白
血清（主要），组织液及外分泌液
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏其抗原结构。
灭活、化学提纯
多种抗原
注射多种抗原
多克隆抗体
从血清中分离
产量低
特异性差
病毒
如何抗体解决产量低和特异性差的问题？
恶性增殖的骨髓瘤细胞
产生抗体的B淋巴细胞
一. 动物细胞融合技术
动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
1. 概念：
2. 原理：
细胞膜的流动性
3. 方法：
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法等
4. 结果：
形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞（杂交细胞）
突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段；为制造单克隆抗体开辟新途径
5. 意义：
二. 单克隆抗体
1. 定义：
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体
二. 单克隆抗体
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
2. 过程：
特定抗原免疫小鼠，从脾中获取产生特定抗体的B淋巴细胞
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
( 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 )
用特定的选择培养基进行筛选，除融合的杂交瘤细胞生长以外，其他细胞都会死亡
96孔板，用于培养和筛选杂交瘤细胞
将细胞培养液稀释后进行接种。每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
( 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 )
抗体检测呈阳
性的杂交瘤细胞
( 分泌的抗体能与特定抗原结合)
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
( 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 )
抗体检测呈阳
性的杂交瘤细胞
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体
小鼠腹腔
注射
体外培养
单克隆抗体
思考
第一次：用特定的选择培养基筛选得到杂交瘤细胞
第二次：用96多孔培养皿培养得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
1、两次筛选的方法和目的分别是什么呢？
2、单克隆抗体的优点？
特异性强、灵敏度高、可大量制备
3. 应用：
1、生物导弹——靶向运输药物治疗疾病
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。
2、作为诊断试剂
用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，再妊娠地8天就可以做出诊断，这笔原来的诊断提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
动物细胞融合 植物体细胞杂交
原理
相关酶
诱导手段
诱导过程
结果
用途
意义
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
胰蛋白酶，胶原蛋白酶
纤维素酶，果胶酶
杂交细胞
杂种植物
培育新品种
克服了远缘杂交不亲和的障碍
使远缘杂交成为可能
制备单克隆抗体等
动物体细胞核移植技术和克隆动物
“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声‘变!’即变作三二百个小猴，周围攒簇。”这是《西游记》中的一段描述。
动物细胞核移植技术
▲我国自主培育的体细胞克隆牛
定义：
将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，进而发育成动物个体的技术。
原理：
动物细胞核的全能性
生殖方式：
无性生殖
分类：
胚胎细胞核移植
体细胞核移植
使用设备从牛卵巢中采集卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
通过显微操作去核
体细胞核移植的过程
为什么要选处于MⅡ期的卵母细胞作为受体细胞？
使用设备从牛卵巢中采集卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
通过显微操作去核
高产奶牛（供体）
取体细胞进行培养
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的牛犊
重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程。
1．为什么要选用处于MⅡ期的卵母细胞作为受体细胞？
2．将供体细胞整个注入去核卵细胞的原因？
3．供体细胞一般用传代几代以内的细胞？为什么？
4、该进程还用了哪些技术？
治疗性克隆
体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
畜牧生产
医药卫生
治疗疾病
保护物种
以患者作为供体培育人核移植胚胎干细胞
转基因克隆动物可以作为异种移植的供体
保护濒危物种，增加存活数量
克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白
加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育
1、干细胞技术、异种（如猪）器官抑制为解决器官移植问题提供了新方法。下列相关叙述正确的是（多选） （ ）
A、器官移植面临着移植供体的来源不足的困难
B、用患者自身干细胞治疗可避免异体移植产生免疫排斥
C、以猪器官作异种器官来源时无需考虑其体内存在的病毒
D、以病毒DNA为载体将体细胞诱导成干细胞有潜在的风险
ABD
2、关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是（ ）
A、组成单克隆抗体的基本单位是氨基酸
B、单克隆抗体仅特异性地对同一抗原进行免疫反应
C、单克隆抗体的制备过程中，第一次筛选是为了选出能分泌特定抗体的杂交瘤细胞
D、单克隆抗体可以广泛应用于疾病的诊断、治疗
E、利用同位素标记的单克隆抗体在特定组织中成像技术可以定位诊断肿瘤
C
3、根据体细胞核移植技术的特点进行推断，体细胞核移植技术可以用来（ ）
A、有效提高濒危物种的遗传多样性
B、提高某些良种家畜的自然繁殖率
C、解决人体器官移植供体来源短缺的问题
D、为科学研究提供实验动物
E、构建转基因克隆动物，作为生物反应器，大规模生产珍贵医用蛋白
CDE

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