资源简介

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聚焦
学习目标：
1.动物细胞融合技术
2.单克隆抗体及其应用
第2 节 动物细胞工程
第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体
病原体
（如流感病毒）
B细胞
抗原呈递细胞
辅助性T细胞
B细胞
记忆B细胞
浆细胞
抗体
1
一些病原体可以和B细胞接触，这为激活B细胞提供了第一个信号。
1
抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞。
3
一些病原体被树突状细胞、B细胞等抗原呈递细胞摄取。
2
2
3
4
5
6
辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合，这是激活B细胞的第二个信号；辅助性T细胞开始分裂、分化，并分泌细胞因子。
4
一.动物细胞融合技术
实例：1970年，科学家用发绿色荧光的染料标记小鼠细胞表面的蛋白质分子，用发红色荧光的染料标记人细胞表面的蛋白质分子，将小鼠细胞和人细胞融合。这两种细胞刚融合时，融合细胞的一半发绿色荧光，另一半发红色荧光。在37℃下经过40min，两种颜色的荧光均匀分布。
小鼠细胞
人细胞
细胞融合
37℃,40min
正常融合的细胞
融合细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验示意图
1.概念
指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜具有一定的流动性。
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG）融合法
生物法：灭活病毒诱导法
2.原理
3.诱导方式
思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
灭活病毒诱导法
①灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
动物细胞融合特有的诱导方法
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（能诱导细胞融合）
②原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
4.过程
细胞膜融合
细胞核融合
细胞质融合
形成杂交细胞
灭活病毒诱导细胞融合过程
5.意义：
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
6.应用：
1)细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
2)利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
至今，种间、属间、科间，甚至动植物之间融合都已获得了成功。
资料 2016年，《ACS Synthetic Biology》杂志上报道了一个日本科学家团队，他们将拟南芥细胞与人类HT1080细胞融合，杂交细胞中产生出了人类/植物融合染色体，同时还能稳定存活、增殖，进行基因表达的案例。
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
7.植物体细胞杂交和动物细胞融合比较
体液免疫
抗体
抗体的分布：
血清（主要）
每个（已经免疫的）B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体
抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的免疫球蛋白
二.单克隆抗体及其应用
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
多种浆细胞
多种抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
抗原不纯
抗体不纯
产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。
缺陷：
如何解决这个问题呢？
抗原
免疫
传统抗血清
所有抗体混合
1.传统抗体制备方法及缺陷
一个极富创造力的方案
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
米尔斯坦【英国】
科勒【德国】
注射特定抗原
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
多种杂交细胞
2.制备过程
1)获得融合细胞
资料分析：HAT培养基
资料1：DNA的合成有D途径和S途径两种途径，其中D途径是在叶酸的辅助下，由氨基酸等小分子合成核苷酸；S途径是利用酶，催化次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）生成相应的核苷酸。
资料2：已知氨基蝶呤（A）是叶酸的拮抗物；免疫的B淋巴细胞有这两种途径，骨髓瘤细胞缺乏S途径中的酶。
培养基中加入
氨基喋呤
活动：请根据以上信息，设计从培养液中筛选出杂交瘤细胞的方案。
细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
合成DNA
D途径
S途径
D途径
氨基喋呤
A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3
02
杂交瘤细胞（多种）
置于选择性培养基上培养
第一次筛选
融合的细胞
B细胞
自身融合
未融合的
B淋巴细胞
B瘤
骨髓瘤细胞
自身融合
未融合的
骨髓瘤细胞
B瘤
B瘤
第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
2)筛选杂交瘤细胞
①筛选杂交瘤细胞，一般用HAT培养基，由次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），3种关键成分配制而成。
②哺乳动物细胞中合成DNA途径有两条：
一条是从头合成途径（简称D途径），氨基蝶呤可以阻断细胞利用D途径合成DNA；
一条是补救途径（简称S途径），该途径需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷用来合成DNA。
③骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。当它处于HAT培养基中，合成DNA的D途径被氨基蝶呤阻断。同时，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途径合成DNA，会很快死亡。
④杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了HGPRT和TK，可以利用S途径来合成DNA。
第一次筛选获得杂交瘤细胞
细胞合成DNA有D和S两条途径
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能合成DNA，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
B淋巴细胞
合成DNA
S途径
D途径
不能分裂增殖
骨髓瘤细胞
合成DNA
D途径
能无限增殖
一般用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞，其中氨基喋呤阻断D途径。
第一次筛选获得杂交瘤细胞
骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。
克隆化培养和抗体检测
★
有限稀释法
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
抗原和抗体能够特异性结合
抗体检测的原理是什么？
(分子水平的鉴定）
3)筛选分泌专一抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞（多种）
第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞
使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
单克隆抗体
体内或体外培养
注射到小鼠腹腔
4)特异杂交瘤细胞的培养
培养杂交瘤细胞的方法比较
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
应用到的技术？
原理？
细胞膜的流动性
多种杂交细胞及未融合的细胞
诱导 融合
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
大量单克隆抗体
克隆化培养、抗体检测
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（能产生抗体）
（能无限增殖）
从腹腔液中提取
从培养液中提取
（进行多次）
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞增殖
单克隆抗体制备过程
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因
筛选 目的 筛选出？ 筛选出 的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
死亡
抗体检测
生长
诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
优点：准确、高效、简易、快速。
3.单克隆抗体的应用
1)作为诊断试剂——最广泛应用
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
艾滋病检测试剂
结合同位素的单抗
血型检测试剂
结合荧光标记的单克隆抗体药物
乙肝测定试剂
ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
2)运载药物（生物导弹）
优点：
位置准确、特异性强、灵敏度高。
3)治疗疾病：主要用于癌症治疗,如PD-1抗体或PD-L1抗体。
优点：位置准确、疗效高、毒副作用小。
1.概念检测
(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(　　)
(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(　　)
(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(　　)
(4)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞(　　)
(5)单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同(　　)
(6)ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用(　　)
2.如图为单克隆抗体的制备流程示意图。下列叙述正确的是(　　)
A.甲是从已免疫的小鼠脾脏中获得的致敏T淋巴细胞
B.①表示将骨髓瘤细胞去核后进行细胞融合
C.乙为融合细胞,同时具有细胞甲和骨髓瘤细胞的特性
D.②表示筛选能产生特异性抗体的细胞
判断正误
3.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
4.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原制备出了单克隆抗体。正确是
A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A

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