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(共64张PPT)
动物细胞工程
动物细胞融合技术与单克隆抗体
一、动物细胞融合技术
实例：1970年，人—鼠细胞荧光标记融合实验
人细胞
鼠细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
细胞融合
人鼠杂交细胞
37°
培养40min
细胞融合
实验表明：细胞膜具有流动性
有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交？
一、动物细胞融合技术
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞
细胞膜具有一定的流动性
1.概念：
4.结果：
2.原理：
3.诱导方式
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG)
生物法：灭活病毒诱导法
与植物原生质体融合的方法相同
——动物细胞融合特有
一、动物细胞融合技术
灭活病毒诱导细胞融合的原理
【拓展】
①灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（能诱导细胞融合）
一、动物细胞融合技术
②灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
一、动物细胞融合技术
5. 过程
细胞膜融合
细胞核融合
细胞质融合
形成杂交细胞
灭活病毒诱导细胞融合过程
动物细胞融合完成的标志
一、动物细胞融合技术
思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
一、动物细胞融合技术
6. 意义：
细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。至今，种间、属间、科间、甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。
2016年，《ACS Synthetic Biology》杂志上报道了一个日本科学家团队，他们将拟南芥细胞与人类HT1080细胞融合，杂交细胞中产生出了人类/植物融合染色体，同时还能稳定存活、增殖，进行基因表达的案例。
一、动物细胞融合技术
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
植物体细胞杂交和动物细胞融合比较
一、动物细胞融合技术
（1）研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
7. 应用
二、单克隆抗体及其应用
早期获得抗体的方法
动物体内
抗原
B淋巴细胞
抗体（血清）
反复
注射
缺点：产量低，纯度低，制备的抗体特异性差。
抗原不纯
抗体不纯
多种
二、单克隆抗体及其应用
要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。
什么细胞能产生抗体？
能产生抗体的细胞能否大量无限增殖？
什么细胞具有无限增殖的能力？
能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？
二、单克隆抗体及其应用
（１）动物体内产生的特异性抗体种类多达百万种；
（２）每个B淋巴细胞（浆细胞）只分泌一种特异性的抗体。
科学家发现：
单
克隆
抗体
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖
需解决问题：
遗憾：
如何解决这一难题？
一个B淋巴细胞
B淋巴细胞群
克隆
单一抗体
二、单克隆抗体及其应用
动物细胞融合
融合细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
浆细胞
肿瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
米尔斯坦【英国】
科勒【德国】
二、单克隆抗体及其应用
1. 制备单克隆抗体的原理
（1）每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，在体外培养条件下，不能无限增殖。
（2）骨髓瘤细胞能无限增殖，不能产生抗体。
（3）通过动物细胞融合技术将两种细胞融合，得到的融合细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。
骨髓瘤细胞
能无限增殖
能产生抗体
B淋巴细胞
二、单克隆抗体及其应用
注射特定抗原
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
多种杂交细胞
2. 单克隆抗体的制备过程
二、单克隆抗体及其应用
杂交瘤细胞（多种）
置于选择性培养基上培养
第一次筛选
融合的细胞
B细胞
自身融合
未融合的
B淋巴细胞
B瘤
骨髓瘤细胞
自身融合
未融合的
骨髓瘤细胞
B瘤
B瘤
第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
二、单克隆抗体及其应用
①筛选杂交瘤细胞，一般用HAT培养基，由次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），3种关键成分配制而成。
②哺乳动物细胞中合成DNA途径有两条：
一条是从头合成途径（简称D途径），氨基蝶呤可以阻断细胞利用D途径合成DNA；
一条是补救途径（简称S途径），该途径需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷用来合成DNA。
③骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。当它处于HAT培养基中，合成DNA的D途径被氨基蝶呤阻断。同时，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途径合成DNA，会很快死亡。
④杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了HGPRT和TK，可以利用S途径来合成DNA。
第一次筛选获得杂交瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
细胞合成DNA有D和S两条途径
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能合成DNA，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
B淋巴细胞
合成DNA
S途径
D途径
不能分裂增殖
骨髓瘤细胞
合成DNA
D途径
能无限增殖
一般用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞，其中氨基喋呤阻断D途径。
骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。
二、单克隆抗体及其应用
抗体检测
第二次筛选
能分泌专一抗体的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）
杂交瘤细胞（多种）
96孔板
96孔板培养和筛选
抗体检测原理：
抗原和抗体能够特异性结合
第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
单克隆抗体
体内或体外培养
注射到小鼠腹腔
二、单克隆抗体及其应用
获取大量单克隆抗体的方法
Ⅰ. 优点：
Ⅱ. 缺点：规模小，产量少
Ⅰ. 优点：可大规模培养，大量生产
①腹腔培养
②体外培养
不需培养基，易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
Ⅱ. 缺点：需要人为控制培养条件，成本相对较高
脾中产生多种
B淋巴细胞
提取
（产生特定抗体）
给小鼠注射特定抗原
培养小鼠骨髓瘤细胞
（能无限增殖）
骨髓瘤细胞
诱导
融合
多种细胞
第一次筛选
特定的
选择性培养基
只有融合的
杂交瘤细胞
克隆化培养、
抗体检测
第二次筛选
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
注射到
小鼠腹腔
大量单克隆抗体
腹水
培养液
B细胞
瘤细胞
B-B细胞
瘤-瘤细胞
杂交瘤细胞
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选 原因
筛选 目的 筛选出 。 筛选出 的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
死亡
抗体检测
生长
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞。
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。
二、单克隆抗体及其应用
①技术：动物细胞融合、动物细胞培养
应用到的细胞工程技术及原理
②原理：细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
二、单克隆抗体及其应用
（1）能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合。
（2）可以大量制备。
3. 单克隆抗体的优点
二、单克隆抗体及其应用
4. 单克隆抗体的应用
①.诊断试剂——最广泛应用
抗原-抗体杂交法
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
在妊娠第8天就可以作出诊断，
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点：
二、单克隆抗体及其应用
4. 单克隆抗体的应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
血型检测试剂
新冠病毒检测试剂
二、单克隆抗体及其应用
4. 单克隆抗体的应用
细胞凋亡
①
ADC被细胞吞噬
②
⑤
ADC
抗体
药物
接头
实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
②运载药物
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC（抗体-药物偶联物）
主要用于癌症治疗。
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
二、单克隆抗体及其应用
4. 单克隆抗体的应用
单克隆抗体+同位素（荧光标记）
②.运载药物
在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
结合荧光标记的单克隆抗体药物
3、治疗疾病
医药领域，单抗类药物占用重要地位
二、单克隆抗体及其应用
单克隆抗体制备过程中的相关考点总结
（1）该过程中应用到的技术_______________________________________
（2）原理_______________________________________
（3）注射特定抗原的目的
____________________________________________________________________________
（4）诱导融合的方法________________________________________________
动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
（5）第一次筛选的目的______________________
第一次如何筛选___________________________
筛选原理____________________________________________________
_____________________________________________________________________
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
动物体细胞核移植技术和克隆动物
“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声‘变！’，即变作三二百个小猴，周围攒簇（cù）。”这是《西游记》中的一段描述，展示了中华先贤的想象力。毫毛来自体细胞，我们能用体细胞“变”出一群猴吗？
我们能否利用类似植物组织培养获得完整植物体的方法培养动物细胞，使其发育成一个完整的个体？
不能，高度分化的植物细胞仍保持着全能性，而动物细胞的全能性会随细胞分化程度的提高逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。因此，目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体。
实现方法：动物体细胞核移植技术
一、动物细胞核移植技术
1. 概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。
2. 原理：动物细胞核的全能性
卵母细胞
动物细胞
去核
取核
移入
重组细胞
发育
新胚胎
发育
克隆动物
用核移植方法得到的动物称为克隆动物
一、动物细胞核移植技术
3. 生殖方式：无性生殖
卵母细胞
动物细胞
取核
去核
移入
重组细胞
发育
新胚胎
发育
克隆动物
一、动物细胞核移植技术
动物的一个细胞（胚胎细胞或体细胞）的细胞核
去核的减数分裂Ⅱ中期（MⅡ期）的卵母细胞
（1）供体：
（2）受体：
4. 动物细胞核移植的供体和受体
卵母细胞
动物细胞
取核
去核
移入
重组细胞
发育
新胚胎
发育
克隆动物
一、动物细胞核移植技术
（1）去核目的：保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞，”核“指的是纺锤体-染色体复合物。
5. 去核的减Ⅱ中期（MⅡ期）卵母细胞
①细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；
②细胞体积大，便于操作；
③卵黄多，营养物质丰富。
（2）作为受体的原因
卵母细胞
动物细胞
取核
去核
移入
重组细胞
发育
新胚胎
发育
克隆动物
一、动物细胞核移植技术
受精卵
囊胚
胎儿
成人
6. 分类与比较
（1）分类
②体细胞核移植：动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难
（2）比较：动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植
①胚胎细胞核移植：动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易
一、动物细胞核移植技术
非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难，原因是什么？
“多莉” 是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物。这一巨大进展证明了分化了的动物细胞核具有全能性。
一、动物细胞核移植技术
7. 非人灵长类动物体细胞核移植非常困难的主要原因
（1）供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低。
（2）对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。
一、动物细胞核移植技术
一般指DNA分子扩增，如PCR技术，还包括单克隆抗体技术。
由一个细胞分裂所形成的细胞群体，如动物细胞培养技术、植物细胞培养技术。
分子水平：
细胞水平：
个体水平：
在生物学上，克隆是无性繁殖，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的分子、细胞或个体。
延伸拓展：克隆（Clone）
指基因型完全相同的个体或群体，如植物组织培养技术、核移植技术。
二、体细胞核移植的过程
将胚胎移入受体(代孕)母牛体内
二、体细胞核移植的过程
重构胚
早期胚胎
激活
卵巢采集
牛卵母细胞
去核的
卵母细胞
供体细胞
高产奶牛
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
显微操作去核
取体细胞
将胚胎移入受体
（代孕）母牛体内
体外培养到MⅡ期
培养
注入
二、体细胞核移植的过程
卵母细胞体积大、容易操作；
卵母细胞营养物质丰富，为发育提供充足营养
卵母细胞质中含有促使细胞核表达全能性的物质
因为10代以内的细胞保证了供体细胞正常的遗传基础。
为何选用MⅡ卵母细胞
问
一般选用10代以内的细胞，为什么？
问
采集卵母细胞，体外培养至MⅡ期
二、体细胞核移植的过程
通过显微操作去核
梯度离心
紫外光短时间照射
化学物质处理
使DNA变性失活，达到去核的目的。
没有刺破卵母细胞膜，对卵母细胞伤害小。
纺锤体——染色体复合物
卵母细胞去核的原因是什么？方法是什么？
问
为使核移植动物的核遗传物质全部来自供体的细胞；
并防止细胞染色体的数量发生变化
方法：显微操作法
二、体细胞核移植的过程
将供体细胞注射入去核的卵母细胞
将供体细胞整个注入去核卵母细胞中的原因
问
对卵母细胞损伤较小；
保证供体细胞的细胞核不被破坏， 操作方便。
高产奶牛(供体)
二、体细胞核移植的过程
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。
重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完成个体的能力。
什么是重构胚？处理重构胚的目的是什么？
问
用物理或化学方法（电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程
将胚胎移入受体
(代孕)母牛体内
克隆犊牛
二、体细胞核移植的过程
重构胚
克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？
为什么？
问
克隆动物遗传物质
细胞核的DNA
来自于供体动物的细胞核
线粒体中的DNA
供体细胞和卵母细胞
生活环境：
性状
可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异
出生与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
二、体细胞核移植的过程
早期胚胎培养
动物细胞培养
胚胎移植
动物细胞融合
重构胚
早期胚胎
激活重构胚
采集牛卵母细胞，体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
高产奶牛（供体）
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
显微操作去核
取体细胞
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
动物体细胞核移植
该过程中应用到了哪些技术？
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
已分化的动物体细胞的细胞核具有全能性
问
该技术证明了什么？
问
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
（1）在畜牧生产中，加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。
1. 应用前景
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
①通过建立转基因体细胞系，再利用此技术培育的转基因克隆动物，可作为生物反应器生产珍贵的医用蛋白。
乳腺生物反应器
（2）医药卫生领域
换成核移植过程相关细胞
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线，包括基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、早期胚胎培养、胚胎移植等步骤，其中过程①是将重组质粒导入受体细胞；过程②需采用胚胎移植技术。
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
②治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官，可作为异种移植。
（2）医药卫生领域
猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。
（2）医药卫生领域
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。
（3）在科研领域
②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因。
③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
（4）在保护濒危动物领域：该技术有望增加濒危物种的存活数量。
黑草黄弄蝶
白鳍豚
金丝猴
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
（1）该技术的成功率非常低，各个技术环节有待进一步改进。
（2）相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合。
（3）绝大多数克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。
2. 存在的问题
胚胎移植 → 动物幼体产出概率＜10％
三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
2003年，世界上第一只用体细胞克隆的动物——多莉，因患有严重的肺部疾病被实施了安乐死。它只活了7岁，而普通绵羊的平均寿命在12岁左右。多莉的死亡引发了关于克隆动物是否早衰的争论。
知识 · 拓展（P55）
一些研究者认为，克隆动物的端粒比较短，基因表达不正常，早衰是一种必然现象。另一些研究者则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中的一些技术问题造成的；或者克隆动物在发育过程中出现了变异，早衰只是偶然现象。
二、单克隆抗体及其应用
（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________
（7）第二次筛选的目的________________________________________________
如何筛选_______________________________________ ____________
选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_________________________________
（8）抗体检测原理_______________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养___________________________
②小鼠腹腔内培养_________________________
（11）单克隆抗体的优点_____________________________
_________________________________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
阳

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