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第2章 细胞工程
第1节 植物细胞工程（第1课时）
学习目标
01
细胞工程的定义与内容
①定义②内容③发展历程
02
03
植物组织培养:
概念,条件,基本流程,实验:菊花的组织培养
细胞的全能性:概念,原因,比较,实例
04
植物体细胞杂交技术:
概念,优缺点,过程,成功案例
原理和方法 生物学和 生物学
操作水平 水平或 水平
目的 按照人的意愿来改变细胞内的 或获得________
分类 细胞工程和 细胞工程
细胞
分子
细胞
细胞器
遗传物质
细胞产品
植物
动物
细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。根据操作对象的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。
细胞工程的定义
细胞工程的内容
1902年，哈伯兰特（G. Haberlandt，1854-1945）提出了细胞全能性的理论，但相关实验尝试没有成功。
1958年，斯图尔特（F. G. Steward，1904-1993）等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960年，科金（E. C. Cocking，1931-）用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1964年，古哈（S. Guha，1938-2007）等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉发育而成的胚。
1890年，希普（W. Heape，1855-1929）将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。
1907年，哈里森（R. G. Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
1951年，张明觉（1908-1991）等发现哺乳动物精子的获能现象。
1958年，格登（J. Gurdon，1933-）用非洲爪蟾进行体细胞核移植，成功培育出性成熟个体。同一时期，童弟周（1902-1979）等开展了鱼类细胞核移植工作。
1959年试管兔诞生，之后多种试管动物相继出生。
1975年，米尔斯坦（C. Milstein，1927-2002）和科勒（G. K hler，1946-1995）等创立了单克隆抗体技术。
1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。
1996年，世界上第一只细胞克隆羊多莉在英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。
1981年，埃文斯（M. J. Evans，1941-）等成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞。
2006年，山中伸弥（S. Yamanaka，1962-）等获得了诱导多能干细胞。我国科学家利用这种细胞培育出了 小鼠。
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
2017年，我国科学家首次培育出体细胞克隆猴。
植物细胞工程
动物细胞工程（含胚胎工程）
1971年，卡尔森（P. S. Carlson，1944-2017）诱导烟草种间原生质体融合，获得种间杂种。
1974年，土壤农杆菌Ti质粒被发现。
兰为王者香，芬馥清风里。
植物组织培养技术
　 讨论：
　 高洁、典雅的兰花颇受人爱，但自然繁育率低，价格不菲。如何让它大量、快速繁殖呢？
从社会中来
植物细胞的全能性
植物组织培养
植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
有丝分裂
植物细胞工程的基本技术
无性生殖
地位
生殖方式
分裂方式
原理
植物组织培养的概念
细胞全能性
细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
每一个细胞含有控制该生物发育的全部基因
原因
（1）生殖细胞＞体细胞
（2）植物细胞＞动物细胞
（3）分化程度越高，全能性越低
比较
细胞的全能性①概念②原因③比较
细胞全能性
细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
体现全能性的实例
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
实例：胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
受精卵发育成个体（动植物）
蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰
用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株
芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶
不体现全能性的实例
受精卵
早期胚胎
分生组织
原因：在特定的时间和空间条件下，基因选择性表达
生物体内细胞并不都表现全能性
没有分化的细胞也具有全能性
如
细胞的全能性④实例
---多肉进行叶插繁殖
1.选取多肉上健康、饱满的叶片。
2.用剪刀切下整片叶片，切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。
3.平躺放在沙床上，叶片间隔相聚2~3厘米。
4.叶片切口不要有碰脏，摆放通风处2~3天，晾干。
5.待叶片晾干后移至半阴处养护。
6.约2~3周后生根，或从叶基处长出不定芽。
7.叶插成功
细胞的全能性④实例
铁皮石斛是一种名贵中药，野生资源十分稀少，其繁殖主要通过植物组织培养实现。下列有关叙述错误的是（ ）
A．用植物组织培养的方法繁殖药材表明在一定条件下，细胞分化是可以逆转的
B．植物细胞的全能性得以表达需要离开母体
C．新植株的形成是细胞分裂和分化的结果
D．高度分化的植物细胞不具有全能性
D
课堂检测:细胞的全能性
外植体
愈伤组织
试管苗
植物体
脱分化
再分化
移栽
离体
无菌
适宜培养基
适宜的外界条件
(温度、光照、气体等)
黑暗
光照
水
琼脂
有机物
无机物
植物激素
蔗糖：提供能量、调节渗透压。
植物激素：主要是生长素和细胞分裂素。
生长素/细胞分裂素适中→促进愈伤组织的形成。
生长素<细胞分裂素→利于芽的分化
生长素>细胞分裂素→利于根的分化
植物组织培养的条件
（1）离体状态
（2）无菌操作
（3）种类齐全、比例适合的营养物质
（4）植物激素（主要是生长素和细胞分裂素）诱导和调节
（5）适宜的外界条件（温度、pH、光照等）
---细胞表现全能性的条件
归纳
（1）材料的选取
同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。菊花的组织培养一般选择未开花植株茎上部新萌生的侧枝。
（2）常用的培养基是____________，主要成分包括：
①____________：N、P、S、K、Ca、Mg等。
②____________：B、Mn、Cl、Zn、Fe、Mo、I、Co等。
③有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、以及________（葡萄糖/蔗糖）等。
MS培养基
大量元素
微量元素
蔗糖
植物组织培养的条件
思考1、MS培养基中为什么用蔗糖而不用葡萄糖？
分析：蔗糖同样可以作为植物细胞的碳源和能源物质。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显______（低于/高于）葡萄糖，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显______（慢于/快于）吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定。此外，微生物生长所需的最适合的碳源是__________，因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可在一定程度上减少____________________。
④植物激素：
_________和______________是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，二者的______、及____________等都会影响实验结果。常用的生长素及类似物有NAA (萘乙酸)、2，4-D等 。常用的细胞分裂素有6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT（激动素）和玉米素。
低于
慢于
葡萄糖
生长素
细胞分裂素
浓度
用量的比例
微生物的污染
植物组织培养的条件
（3）外界条件：如pH、温度、光照等环境条件。
思考2、组培时，光照条件该如何控制？
分析：形成愈伤组织以及愈伤组织的扩大培养需______，诱导愈伤组织再分化出芽需______。
思考3、胡萝卜组织培养时，若选取胡萝卜韧皮部细胞，______（能/不能）培养出完整植物体。与韧皮部细胞相比，选取胡萝卜形成层细胞进行组培更______。
避光
照光
能
容易
使用情况 实验结果
生长素用量/细胞分裂素用量的比值高
生长素用量/细胞分裂素用量的比值低
生长素用量/细胞分裂素用量的比值适中
促进根分化，抑制芽形成
促进芽分化，抑制根形成
促进愈伤组织的形成
植物组织培养的条件
植物组织培养的基本流程
外植体
愈伤组织
芽、根
植株
脱分化
再分化
外植体：用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。
愈伤组织：细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团。
胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程。
再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程。
探究实验:菊花的组织培养
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
完整植株
移栽
1、原理：
2、目的：
1）了解植物组织培养的基本原理
2）了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例对菊花愈伤组织形成
和分化的影响
3）尝试进行植物组织培养
3、步骤：
1）制备外植体
2）接种到诱导愈伤组织培养基
3）接种到诱导生芽培养基
4）接种到诱导生根培养基
探究实验:菊花的组织培养
（1）制备外植体
消毒：
切割：（无菌操作）
酒精
30S
无菌水
2-3次
次氯酸钠溶液
30min
材料：
幼嫩的菊花茎段
2-3次
无菌水洗
超净工作台或接种箱
消毒与无菌水冲洗
切割与接种
（2）接种到诱导愈伤组织培养基
脱分化 避光
形成愈伤组织
有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
愈伤组织培养
培养温度：
18-220C
无菌培养皿
灭菌的解剖刀
探究实验:菊花的组织培养
一定不能倒置
诱导愈伤组织形成
避光培养
诱导生芽、生根
1.照光培养
2.生芽、生根培养基不同
试管苗移栽
外植体接种：将外植体的1/3~1/2插入诱导愈伤组织培养基
(3）接种到诱导生芽培养基
（4）接种到诱导生根培养基
若先生根后面就不易生芽
愈伤组织
见光后愈伤组织变为绿色
愈伤组织
植物组织培养的基本流程
生长素/细胞分裂素比例适当
细胞分裂素含量较高
生长素含量较高
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
小结:植物组织培养
小结:植物组织培养
外植体
愈伤组织
幼苗（芽、根）
植株
离体
控制光照
温度
pH
脱分化
再分化
移栽
比例适中
照光
无菌
激素 生长素
细胞分裂素
营养 有机物
无机盐
凝固剂
（琼脂）
避光
配比低→发芽
配比高→生根
MS
培养基
大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg
大量元素：Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo
单倍体
植株矮小、高度不育
花药离体培养
易错警示
培养过程中只涉及有丝分裂
生殖方式为特殊的有性生殖
花药
试管苗
脱分化
再分化
愈伤组织
特殊的植物组织培养
下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是（ ）
A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
B．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化
C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同
D
课堂检测
下图是植物组织培养技术培育新品种的部分过程图。
（1）该技术的核心操作是__________和__________。
（2）愈伤组织是一类高度液泡化、呈无定形状态的具有_____能力的薄壁细胞。
（3）培育 F 植株的过程中，除需无菌环境外，还需向培养基中添加的激素有__________________________。
（4）该操作能够得到 F 植株，体现了_________________；F 植株________（填“可育”或“不可育”）。
脱分化
再分化
分生
生长素和细胞分裂素
花粉细胞的全能性
不可育
课堂检测
“番茄-马铃薯”的假想图
植物体细胞杂交技术
讨论：
1. 地上结番茄，地下长土豆的植株通过有性生殖可以产生吗？
2. “番茄-马铃薯”，通过什么技术能够获得呢？
过渡
植物体细胞杂交
将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的方法。
“白菜-甘蓝”
细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
原理
染色体数目变异
可遗传变异类型
细胞工程育种
育种类型
植物体细胞杂交技术①概念
植物体细胞杂交
为什么“番茄-马铃薯”不像所预想的那样：地上结番茄，地下结马铃薯呢？
生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的。
打破生殖隔离
实现远缘杂交
优点
杂种植株所表现性状未必符合需求
缺点
植物体细胞杂技术②优缺点
提示：马铃薯基因组的____________可能影响了番茄基因组的表达，番茄基因组的表达产物也可能影响了马铃薯基因组的表达，导致融合植株细胞中的基因不能______表达。
表达产物
有序
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
植物细胞融合 + 植物组织培养
植物体细胞杂技术③过程
原理
细胞膜的流动性 植物细胞全能性
①
方法：酶解法。
a.植物细胞去掉细胞壁，形成原生质体。
利用酶的专一性。
用纤维素酶和果胶酶水解。
植物体细胞杂技术③过程:酶解法去壁
光镜下烟草叶肉细胞原生质体
为什么纤维素酶和果胶酶需溶于一定浓度溶液中？
保持原生质体正常的形态，防止其吸水过多而胀破。
原生质体与原生质层
指的是脱去细胞壁的细胞。动物细胞也可看做是原生质体。
原生质体
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质。
原生质层
VS
原生质层不包括细胞液和细胞核
植物体细胞杂技术③过程
植物体细胞杂技术③过程:诱导原生质体的融合
b.诱导两个细胞（原生质体）融合
细胞膜的流动性
原理
方法
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH值融合法
化学方法
物理方法
融合完成的标志是重新产生细胞壁，形成杂种细胞。
植物体细胞杂技术③过程:筛选杂种细胞
野生马铃薯(A)和栽培马铃薯(B)原生质体融合
（电融合法）
融合后，培养基中有几种类型的细胞？
A、B、AA、BB、AB。（只考虑两两融合）
需要进一步筛选
通电之前
通电2min后
通电3min后
通电10min后
思考:诱导融合之后为什么要对原生质体进行筛选？
分析：融合体系中有多个原生质体A和多个原生质体B，由于融合是______的，所以除了会出现融合原生质体AB，也会出现____________________和____________________；又由于融合的的成功率不是百分之百，所以除了会出现融合细胞，也会有_______________。因此诱导融合之后要对原生质体进行筛选。
随机
融合原生质体AA
融合原生质体BB
未融合细胞
随机
选出AB型(杂种) 细胞的方法
方法1：互补选择法
第一次培养在适合A不适合B的条件下
第二次培养在适合B不适合A的条件下
淘汰B和BB型的细胞
淘汰A和AA型的细胞
选出AB型细胞
方法2：融合前两个亲本有可分辨的明显标记
亲本1：来自愈伤组织
亲本2：来自叶肉细胞(含叶绿体)
细胞壁薄且含有叶绿体的细胞
选择
植物体细胞杂技术③过程:筛选杂种细胞
植物体细胞杂技术③过程:筛选杂种细胞
方法3：利用抗性互补
亲本1：对放线菌素D有抗性，但在MS培养基不能超过50个世代
亲本2：对放线菌素D敏感，但能在MS培养基生生长。
将杂种细胞培养在含有放线菌素D的MS培养基上即可。
选出AB型(杂种) 细胞的方法
高尔基体
A为2a=20
B为2b=30
50
4
杂种细胞染色体数为？
此过程中起主要作用的细胞器是？
杂种细胞染色体组数为？
植物体细胞杂技术③过程:筛选杂种细胞
两亲本染色体数之和
两亲本染色体组数之和
利用植物组织培养技术将杂种细胞培育成杂种植株。
植物体细胞杂技术③过程:杂种细胞的全能性的体现
标志着杂种细胞具有全能性。
项目 体细胞杂交 P1：2n(Aabb) 与 P2：2m(ccDd)
生殖类型
变异类型
染色体数
染色体组数
基因组成
植物体细胞杂交后代的遗传变化
无性繁殖，育种过程中不遵循孟德尔定律
染色体数目变异
两亲本染色体数之和。2n+2m
两亲本染色体组数之和。2+2
两亲本基因型之和。AabbccDd
小结:植物体细胞杂技术
烟草-海岛烟草
胡萝卜-羊角芹
白菜-甘蓝
普通小麦-长穗偃麦草
人参-胡萝卜（提高了人参皂苷的产量）
我国科学家培育出了多种柑橘属不同种间的杂种植株。
芦柑、柠檬、橙子
柚子、橘子、枸橼
植物体细胞杂交技术④成功案例
杂种植株中遗传物质为亲本植株之和。
若亲本植株可育，则杂种植株可育。
杂种植株是不同于亲本的新物种。
思考:据报道，某男子培育出一株奇怪的植株，实现了“地上长番茄、地下结马铃薯”，你认为该男子可能是利用什么方法获得的该植株？
分析：______________________________________________________。
接穗
砧木
嫁接 以土豆植株为砧木，以番茄植株为接穗
课堂检测
植物体细胞杂交要先去除细胞壁的原因是（ ）
A．植物体细胞的结构组成中不包括细胞壁
B．细胞壁使原生质体失去活力
C．细胞壁阻碍了原生质体的融合
D．细胞壁不是原生质体的组成部分
C
课堂检测
以下为植物体细胞杂交技术流程图，其中甲和乙分别表示两种二倍体植物细胞，所含有的染色体组分别是AA和BB。据图分析正确的是 （　　）
A．经①过程获得的a、b称为原生质层
B．c细胞只有AABB这一种类型
C．过程④和⑤分别是分化和再分化
D．获得植物d因为有同源染色体所以可育
D
甲
乙
课堂检测
需要进一步筛选
利用相关工程技术可以获得抗黑腐病杂种黑芥-花椰菜植株，流程如下图。已知野生黑芥具有黑腐病的抗性基因，紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。
（1）过程①用________________酶去除植物细胞壁，过程②PEG的作用是____________________，
（2）经过②操作后，需筛选出融合的杂种细胞，显微镜下观察融合的活细胞中有_______________可作为初步筛选杂种细胞的标志。
纤维素酶和果胶
叶绿体存在
促进原生质体融合
光照培养的抗病型黑芥幼叶
暗培养的易感型花椰菜幼根
叶肉细胞原生质体
根细胞原生质体
②
PEG
①
愈伤组织
再生植株
杂种植株
鉴定
紫外线
课堂检测

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