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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
菌落
学习目标
01
微生物的基本培养技术
①培养基的配制
②无菌技术
③微生物的纯培养
02
微生物的选择培养和计数
①选择培养基
②微生物的选择培养基
③微生物的数量测定
从社会中来
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。
一般家庭自制酸奶可能会导致肠胃不适，主要原因是有杂菌混入。
那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术
微生物的基本培养技术
微生物的类群
原核生物 (细菌、蓝细菌等)
原生生物 (如草履虫、衣藻等)
真菌 (如酵母菌、霉菌等)
酵母菌
青霉菌
大型真菌
球菌
蓝细菌
放线菌
草履虫
衣藻
病毒
禽流感病毒
SARS病毒
是难以用肉眼观察的微小生物的统称，
包括细菌、真菌、病毒和一些原生生物等。
本章提及的微生物主要是用于发酵的细菌和真菌。
微生物的基本培养技术
菌 落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
单菌落：一般是单个微生物繁殖形成的纯培养物。
A：支原体的菌落
B：酵母菌的菌落
C：细菌的菌落
D：细菌和霉菌混杂的菌落
E：放线菌的菌落
F：霉菌的菌落
微生物的基本培养技术
微生物的类群
是难以用肉眼观察的微小生物的统称，
包括细菌、真菌、病毒和一些原生生物等。
本章提及的微生物主要是用于发酵的细菌和真菌。
菌 落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
单菌落：一般是单个微生物繁殖形成的纯培养物。
微生物的基本培养技术
一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。菌落特征是鉴定菌种的重要依据。
形态
突起
(侧面观)
边缘
(部分)
标点状
圆形
丝状
不规则状
假根状
纺锤状
扁平
隆起
凸透镜状
垫状
脐突状
完整
波状
裂片状
啮蚀状
丝状
卷曲状
思考1:肺炎双球菌的S型菌和R型菌的菌落特征有什么区别？
思考2:有鞭毛的细菌和无鞭毛的细菌其菌落边缘有何不同？
微生物的基本培养技术
实验室培养微生物条件
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
——培养基
2）确保其它微生物无法混入
——无菌技术
高压蒸汽灭菌
微生物的基本培养技术
培养基的配制
1、培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
3、培养基类型：
固体
培养基
液体
培养基
有 无 琼脂
分离、计数、鉴定等
扩大培养、
工业生产
2、培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
微生物的基本培养技术
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
（补充资料1) 培养基的类型及用途P11
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
微生物的基本培养技术
选择培养基
①基础培养基+青霉素→分离酵母菌等真菌
②基础培养基+高浓度食盐→分离金黄色葡萄球菌
③无碳源培养基→分离自养微生物
④无氮源培养基→分离固氮微生物
⑤以尿素为唯一氮源→分离分解尿素的细菌
⑥以石油为唯一碳源→分离能消除石油污染
微生物的基本培养技术
大肠杆菌的代谢产物（有机酸）能与伊红美蓝结合，从而形成深紫色、并带有金属光泽的菌落。
伊红美蓝培养基
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。
微生物的基本培养技术
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。
刚果红 + 纤维素 → 红色复合物
纤维素分解菌周围出现透明圈
纤维素分解菌 → 纤维素酶 → 纤维二糖 + 葡萄糖（不能与刚果红形成红色复合物）
微生物的基本培养技术
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。
①油脂培养基鉴别产脂肪酶的菌株→由淡红色变成深红色
②H2S试验培养基鉴别产H2S菌株→产生黑色沉淀
③加入酚红指示剂鉴别分解尿素的微生物→菌落周围变成红色
给微生物提供碳元素的物质
自养生物：CO2
异养生物：含碳的有机物
给微生物提供氮元素的物质
固氮微生物：空气中的N2
非固氮微生物：NH4+ 、 NO3- 、尿素、含N有机物
水
无机盐
速效碳源：淀粉、葡萄糖
迟效碳源：纤维素（纤维素分解菌）
碳源：
氮源：
4、培养基的营养构成:
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
微生物的基本培养技术
(2)还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及对氧气的要求。
（如维生素、氨基酸和碱基等）
例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加_________，培养霉菌时需将培养基的pH调至____性，
培养细菌时需将pH调至_____________，培养厌氧微生物时则需要提供_______的条件。
维生素
酸
中性或微碱性
无氧
1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
水 定容至1000mL 水
微生物的基本培养技术
无菌技术
泛指在培养微生物的操作中，避免杂菌污染的方法。
主要包括消毒和灭菌
两个方面：
消毒
对操作的空间、操作者的衣着和手
灭菌
培养细菌用的培养基与培养皿
玻棒、试管、烧瓶、吸管和接种环等
还要注意：
避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触
为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
思考:无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外, 还有什么作用
还能有效避免操作者被微生物污染.
微生物的基本培养技术
无菌技术
1、消毒
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
（1）概念：
（2）消毒的方法：
①煮沸消毒法： 100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法： 62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台
⑤生物消毒法: 指利用生物或其他代谢物去除环境中的部分微生物的方法.
微生物的基本培养技术
无菌技术
2、灭菌
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
微生物的基本培养技术
无菌技术
2、灭菌
　　
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）灭菌的方法：
①灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过
程中的试管口或瓶口等易被污染部位
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h
微生物的基本培养技术
无菌技术
2、灭菌
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）灭菌的方法：
干热灭菌箱
在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强,必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的。因此，干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法_____。
高
微生物的基本培养技术
无菌技术
2、灭菌
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）灭菌的方法：
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的
某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
对象：培养基等
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
③湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min
高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌法（排气-升压-保压-降压）
高压蒸汽灭菌法（排气-升压-保压-降压）
121°C
1.5--2个大气压
15分钟 -- 30分钟
适用于培养基、生理盐水、缓冲液、玻璃器皿和工作服等
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
3.无菌的方法：
消毒与灭菌
接种室、接种箱，超净工作台
微生物的基本培养技术
课堂检测
无菌技术
思考1:培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？
分析：干热灭菌箱内的高温会导致培养基的_________丧失，而高压蒸汽锅内的_________较大，不会导致培养基的_________散失 。
思考2:如何制备一瓶无菌水？
分析：对一瓶有菌水进行___________________处理。
思考3:某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是？
分析：_____________________。
思考4:某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是？
分析：___________________________________________，就提前打开了高压蒸汽锅。
思考5：用紫外线可以给接种室消毒，其原理是紫外线能___________________。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等_________，可以加强消毒效果。
水分
湿度
水分
高压蒸汽灭菌
未将锅内冷空气排尽
高压蒸汽锅的压力表读数还未降至零
损伤细菌的DNA
消毒液
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
（1）概念：
（2）内容：
1）配制培养基
2）调pH、分装
3）灭菌（培养基和器具）
4）接种和分离
5）恒温箱中培养
微生物的基本培养技术
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
探究-实践
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
1、菌落：
2、纯培养：
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
3、原理：
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
微生物的基本培养技术
方法步骤
1、制备培养基
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
马铃薯
(200g)
去皮
马铃薯块
切块
加水
(1000mL)
煮沸
软烂
马铃薯
纱布过滤
滤液
加葡萄糖/蔗糖
(20g)
加琼脂
加水定容
(1000mL)
酵母菌培养基
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
1）配制培养基
方法步骤
1、制备培养基
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
2）灭菌
酵母菌培养基
转移
包牛皮纸
锥形瓶
加棉塞
皮筋勒紧
放入高压蒸汽灭菌锅中(100kPa、121℃)
灭菌15~30min
方法步骤
1、制备培养基
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
2）灭菌
5~8套
培养皿
几层牛皮纸包紧
灭菌2h
放入干热灭菌箱(160~170℃)
包器材
方法步骤
1、制备培养基
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板
拔出锥形瓶的棉塞
将瓶口迅速通过火焰
用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养皿(10~20mL)倒入培养皿，立即盖上皿盖
待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置
翻转
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
2）倒平板
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
5.将制备的空白平板，置于恒温培养箱中培养一段时间，平板上长出了菌落，可能的原因是？
2、接种和分离酵母菌
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
平板划线法
稀释涂布平板法
2、接种和分离酵母菌
平板划线法:通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
(1)原理：
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
连续划线法
分区划线法
(2)“平板划线”实验操作
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
2、接种和分离酵母菌
平板划线法
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
1．将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
2．在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装出酵母菌培养液的棉塞。
3．将试管口通过火焰。
4．在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
5．将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
6．在火焰旁打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划3～5条平行线，盖上盖子。
7．灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
方法步骤
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
分区划线法
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
微生物的基本培养技术
问题探讨
酵母菌的纯培养
探究-实践
2、接种和分离酵母菌
稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释,然后将不同的稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基表面,进行培养。
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
2、接种和分离酵母菌
稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释,然后将不同的稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基表面,进行培养。
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
课堂检测
接种和分离
平板划线
连续划线
稀释分散
灼烧
冷却
末端
一
划破
稀释涂布平板
梯度稀释
稀释度
涂布
灭菌
酒精灯火焰旁
70%酒精
冷却
分布均匀
3、培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h.
结果分析与评价
1、未接种的培养基表面是否有菌落生长，如果有，说明了什么？
2、在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了菌落？这些菌落的颜色、形状、大小是否一致，如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析可能是哪些原因引起的吗？
微生物的基本培养技术
应该没有 如果有,则说明培养基被杂菌污染
如果观察到了不同形态的菌落,可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范等原因引起的.
酵母菌的纯培养
探究-实践
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
微生物的基本培养技术
思维训练
评估论点的可信程度
评估“水果酵素”的功效是否真实？ P14阅读讨论
所谓“酵素”就是”酶”的另一种说法。
“酵素”制作就是利用微生物无氧呼吸的原理,进行泡菜一样的发酵。
成分:可能含有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维),蛋白质(包括多种酶),有机酸等成分,不存在它独有的特殊的营养物质,甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质,食用后可能会危害人体健康.
微生物的选择培养和计数
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
微生物的选择培养和计数
美国黄石国家公园的一个热泉
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
②原理:实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
①在寻找目的菌株时,要根据它相对应的生存环境的要求,到相应的环境中去寻找.
筛选菌株的思路：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
①基础培养基+青霉素→分离酵母菌等真菌
②基础培养基+高浓度食盐→分离金黄色葡萄球菌
③无碳源培养基→分离自养微生物
④无氮源培养基→分离固氮微生物
⑤以尿素为唯一氮源→分离分解尿素的细菌
⑥以石油为唯一碳源→分离能消除石油污染
微生物的选择培养和计数
选择培养基:
将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
微生物的选择培养和计数
思考:那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论：
1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
培养基只是添加尿素作唯一氮源，其他营养成分基本相同。
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释,然后将不同的稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基表面,进行培养。
1、概念：
2、用途：
a.用于微生物的纯培养;b.用于选择筛选微生物;
c.用于统计样品中活菌的数目.
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品中的一个活菌;通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约有多少活菌.
3、原理：
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
4ⅹ107
4ⅹ105
4ⅹ104
4ⅹ103
4ⅹ107
（2）计算公式：
___g土中的菌株数 =（C÷V）× M
C：代表______________________
V：代表___________________ M：______________
1
某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
涂布平板时所用的稀释液体积
稀释倍数
思考:甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。
(目的:减少偶然误差)
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
(原因:当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落.)
④分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作
有误，需重新实验。
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
显微镜直接计数：
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
细菌计数板
菌落数
微生物的选择培养和计数
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
稀释涂布平板法
2）土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
1）制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
3）样品梯度稀释：
在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
4）接种:取样涂布平板
放入37℃恒温箱中培养1～2d
5）培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
微生物的选择培养和计数
稀释涂布平板法
实验的具体操作：
中性
潮湿
唯一氮源
104、105和106
放线菌
102、103和104
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
微生物的选择培养和计数
稀释涂布平板法
实验的具体操作：
时间
温度
菌落数目稳定
培养时间不足
平均值
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
微生物的选择培养和计数
操作提示：
1、无菌操作：
①取土样的用具在使用前都需要灭菌。②应在__________________旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在酒精灯火焰旁操作。
2、做好标记：
本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好_________。
①培养皿的标记：注明__________、______________以及平板上培养样品的_____________等。
②试管的标记：将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放在试管架的另一行。
3、制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。
酒精灯的火焰
标记
培养基种类
培养日期
稀释度
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
微生物的选择培养和计数
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
在以尿素为唯一氮源的培养基中，只有能分解尿素的细菌才能利用尿素这种氮源来生长繁殖，并长出菌落。尿素分解菌产生的脲酶能将尿素分解成CO2和NH3，NH3溶于水会电离出NH4+和OH-，使培养基的pH升高。
在该培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果菌落周围变红，说明该细菌能够分解尿素。
实验结果：
微生物的选择培养和计数
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
实验结果分析与评价：
无菌落生长
有菌落生长
大于
30-300
微生物的选择培养和计数
到社会中去
1、空气中微生物总数的检测？
2、水中细菌总数的检测？
3、牛奶中细菌的分离与计数？
4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数？

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