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第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
二、基因表达载体的构建
思考·讨论
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞？
即使可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解。
不能
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
1. 构建的目的
（1）让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
（2）同时使目的基因能够表达和发挥作用。
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
基因表达载体
抗虫基因
与载体拼接
2. 载体组成
（1）启动子：
①本质：一段有特殊序列结构的 片段。
DNA
②位置：位于基因的 ，
紧挨 。
上游
转录的起始位点
③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
表达载体
启动子
目的基因
终止子
复制原点
标记基因
诱导型启动子
诱导物
作用
目的基因表达
激活或抑制
④诱导型启动子：有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
（2）终止子：
①本质：一段有特殊序列结构的 片段。
DNA
②位置：位于基因的 。
下游
③功能：使转录在所需要的地方停下来。
（3）标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型：
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
启动子
终止子
标记基因
复制原点
目的基因
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
（4）目的基因：
主要是指编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状，如Bt基因。
（5）复制原点：
DNA复制的起始位点。
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
总结：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
重组质粒
3. 构建过程
（1）首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
限制酶
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
3. 构建过程
（2）然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
同种
相同
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
3. 构建过程
（3）再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
DNA连接酶
载体
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
3. 构建过程
注意：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。
问题：使用同种限制酶进行切割，共有几种连接情况
思考 讨论 用同种限制酶切割（单酶切）载体和目的基因有什么缺点
4. 限制酶的选择原则
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
问题：使用同种限制酶进行切割，共有几种连接情况
4. 限制酶的选择原则
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
1’
1
2’
正向连接
思考 讨论 用同种限制酶切割（单酶切）载体和目的基因有什么缺点
4. 限制酶的选择原则
②质粒与目的基因会发生反向连接
①质粒、目的基因会发生自身环化连接
用两种限制酶切割（双酶切）质粒和含有目的基因的DNA片段。
限制酶a切割
a
b
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
思考 讨论如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
4. 限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因：切点应位于目的基因两端，如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
（3）确保出现相同黏性末端原则：切割目的基因与质粒所选的限制酶应产生相同的黏性末端。
①可以选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ。
4. 限制酶的选择原则
（3）确保出现相同黏性末端原则：
②为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），应使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
4. 限制酶的选择原则
4. 限制酶的选择原则
三、将目的基因导入受体细胞
基因表达载体
导入
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。
三、将目的基因导入受体细胞
1. 将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
①受体细胞：
受精卵
三、将目的基因导入受体细胞
萌发的花粉管
柱头
花柱
子房
胚囊
卵细胞
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
①受体细胞：
受精卵
植物经过开花和传粉之后，花粉飘落在雌蕊的柱头上，花粉受到柱头分泌的黏液的刺激，就萌发出花粉管。花粉管沿着花柱向子房内生长。花粉管内有精子。
当花粉管从珠孔进入胚珠后，其末端破裂，精子被释放出来，与卵细胞结合，成为受精卵。这样就完成了受精过程。
萌发的花粉管
柱头
花柱
子房
胚珠
卵细胞
精子
珠孔
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
②操作方式
Ⅰ. 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
含目的基因的DNA溶液
外源DNA进入受精卵，并进行随机整合。
子房
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
②操作方式
Ⅱ. 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
胚囊
花柱滴加优点
① 利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
② 操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
（2）农杆菌转化法
①转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，实质是基因重组。
三、将目的基因导入受体细胞
1. 将目的基因导入植物细胞
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种微生物，它能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，并诱导产生冠瘿瘤等。
科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有。
为什么农杆菌容易感染双子叶植物？
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
（2）农杆菌转化法
②农杆菌特点
Ⅰ. 在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
冠瘿瘤
T-DNA
Ti质粒
大型环状DNA
农杆菌
Ⅱ. 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2）农杆菌转化法
②农杆菌特点
将目的基因插入 中，通过农杆菌的 作用，就可以使目的基因 。
③转化的原理
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
（2）农杆菌转化法
1. 将目的基因导入植物细胞
目的基因
Ti质粒
表达
载体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
④转化过程
（2）农杆菌转化法
1. 将目的基因导入植物细胞
Bt基因转入棉花细胞
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
将目的基因插入
染色体DNA中
表现出新性状的植物
目的基因
Ti质粒
④转化过程
（2）农杆菌转化法
Ⅰ. 两次拼接
第一次拼接：
目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。
第二次拼接：
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
第1次拼接
第2次拼接
④转化过程
（2）农杆菌转化法
Ⅱ. 两次导入
第一次导入：
将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。
第二次导入：
含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
第1次导入
第2次导入
④转化过程
（2）农杆菌转化法
Ⅰ. 将新鲜的从叶片上取下的圆形小叶与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
该方法受体细胞为 。
⑤具体转化方法
（2）农杆菌转化法
体细胞
Ⅱ. 将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。
该方法受体细胞为 。
⑤转化的具体方法
（2）农杆菌转化法
受精卵
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得成功。
2. 将目的基因导入动物细胞
（1）最常用的方法：
（2）受体细胞：
为什么选用受精卵作为受体细胞呢？
显微注射法
受精卵
三、将目的基因导入受体细胞
① 体积大，易操作。
② 全能性高，易培养成完整个体。
受精卵
注射器
固定吸管
2. 将目的基因导入动物细胞
构建基因表达载体
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（3）过程
3. 将目的基因导入微生物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞：
一般用Ca2+处理法
常用原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
优点：
生理结构和遗传物质简单，生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作。（教材P101）
三、将目的基因导入受体细胞
（3）过程
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+处理细胞
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性。
这种细胞称为感受态细胞
3. 将目的基因导入微生物细胞
Ca2+
感受态细胞
吸收
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，需要在体外进行再加工。
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时。若无法获得该蛋白，原因可能是什么？如何解决？
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。
若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
4. 将目的基因导入不同细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化 过程
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
不要着急，精彩继续！

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