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第三章 基因工程第1节重组DNA技术的基本工具1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。基因工程发展历程1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。思考如何获得发光小鼠动物细胞融合技术基因工程图解“基因工程实质”转移萤火虫普通动植物发光基因A生物基因B生物基因工程的概念指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。基因工程对象原理优点基本过程基因剪切→拼接→导入→表达基因重组克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状基因重组的三种类型基因重组指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因重新组合。①同源染色体分离，非同源染色体的非等位基因自由组合②四分体期，同源染色体的非姐妹染色单体交叉互换③转基因技术1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(3)都遵循碱基互补配对原则(1)DNA是主要遗传物质。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。分析基因工程的理论基础思考基因工程如何操作？需要什么工具？苏云金杆菌中的Bt基因基本原理普通棉花细胞含Bt基因的棉花细胞能产生Bt抗虫蛋白的棉花植株转入植物组织培养技术形成转基因抗虫棉目的基因的表达产物目的基因普通棉花转基因抗虫棉受体细胞Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”重组DNA技术的基本工具剪接运需要什么工具？磷酸二酯键
1.来源：
2.功能：
3.作用的化学键：
一、“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开
磷酸二酯键
(3号碳上的酯键）
原核生物
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（酶的专一性）
EcoRⅠ
3’端
3’端
5’端
5’端
能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列。
2.限制酶的识别序列特点：
为什么限制酶可以识别剪切核酸？
特点1：都可以找到一条中（心）轴线；
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致，5 ，→3，
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTCGATTTAGDEcoR I(在G与A之间切割)Sma I(在G与C之间切割)5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端一、限制性内切核酸酶（限制酶）回文序列一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。最终产生两种切口的核酸片段
2个相同（互补）黏性末端
识别序列：GAATTC
切割位点：GA之间的磷酸二酯键
形成黏性末端（从5’往3’读）：AATT
EcoRⅠ限制酶：
若一个限制酶切割一次
可断开 个磷酸二酯键
①形成 个相同（互补）的黏性末端
消耗 分子水
②形成___个游离的磷酸基团
2
2
2
2
黏性末端特点
③产生___个切口
1
若一个限制酶切割一次
可断开 个磷酸二酯键
①形成 个相同平末端
消耗 分子水
②形成___个游离的磷酸基团
2
2
2
2
平末端特点
③产生___个切口
1
1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？
可产生几个黏性末端/平末端？
切两个切口，产生四个黏性末端/平末端。
相关思考
写出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC总结不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端同尾酶识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶限制性核酸内切酶的命名限制酶是如何命名的呢？是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:Hind IHind IIHind III1、你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。旁栏思考题2、试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？原核生物中不存在该酶的识别序列，或识别序列已被修饰使限制酶不与之结合用同种限制酶切割(EcoRⅠ)T G A A T T C GA C T T A A G CA G A A T T C TT C T T A A G A问题:把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？缺口怎么办将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。GCT TA AA AT TCGGC T T A AA AT TCG二、DNA连接酶——“分子缝合针”二、DNA连接酶——“分子缝合针”类型E.coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源功能只缝合____________缝合____________和____________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯键3、种类和作用：（效率较低）DNA聚合酶也可以形成磷酸二酯键，能否用DNA聚合酶？A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶作用方式项目DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键DNA连接酶与DNA聚合酶的比较与DNA相关的五种酶的比较酶1酶2酶4酶3酶5酶1:限制酶 酶2:DNA连接酶 酶3:解旋酶酶4:DNA聚合酶 酶5:DNA水解酶要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具就是载体，被称为分子运输车。
三、基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”
三、基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”
1.常用载体--质粒：
质粒定义：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
质粒的本质
质粒作为载体的优势：
具有一个至多个限制酶切割位点
进行自我复制
便于重组DNA分子的鉴定和筛选
标记基因
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
2.载体需要具备的条件：
基因可插入其中：具有一个至多个限制酶切割位点；
复制的能力：能在受体细胞中复制并稳定保存；
带有特殊的标记基因：便于筛选和鉴定；
对受体细胞无害（安全性）；易分离获得。
3.其他载体：
噬菌体、动植物病毒等
三、基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”
思考：
噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是 。
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种特异
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
种类 用途 不同点
质粒 噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入细菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别
4.种类：
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
三、基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”
——鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
标记基因的作用
导
思考·讨论：重组DNA分子请你在上述序列中找到EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。注：选择限制酶的要求① 选目的基因两端和载体都有的酶切位点，确保出现相同的黏性末端② 所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因③ 选择两种限制酶的优点：防止目的基因和载体自身环化、反向连接1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
小结：基因工程的基本工具
四、探究实验:
DNA的粗提取和鉴定
【探究与实践】
DNA的粗提取与鉴定
材料用具
1.选材：
DNA含量 的生物组织，
相对较高
如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中
没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
2.试剂：
①研磨液
——破坏细胞，释放出细胞内的物质
②体积分数为95%的酒精
——析出DNA
③2mol/L 的NaCl溶液
——溶解DNA
④二苯胺试剂
——鉴定DNA
（要现配现用）
⑤蒸馏水
（洗涤剂和食盐）
方法步骤
1.破碎细胞——
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，
研磨。
洋葱
研磨液
充分
【思考】如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，
从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。
2.去除杂质——
在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
纱布
上清液
上清液
【思考】过滤能否用滤纸代替纱布？
不可以。
因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
方法步骤
3.DNA的粗提取——
【思考】此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？
可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。
在上清液中加入体积相等的 溶液,
静置2~3min，溶液中出现的 就是
粗提取的DNA 。
预冷的酒精
白色丝状物
【思考】此步骤的目的是？
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
【拓展】预冷的酒精的优点
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
析出DNA
方法步骤
析出DNA
3.DNA的粗提取——
用玻璃棒沿 搅拌，卷起 ，并用滤纸吸去上面的水分：
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。
一个方向
沉淀物
【思考】为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？
避免破坏DNA
4.DNA的鉴定——
取 20mL的试管，各加入 的NaCl的溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。
然后，向两支试管中加入4mL的 试剂。混合均匀后，将试管置于 中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中颜色的变化。
实验组
对照组
2mol/L
二苯胺
沸水
丝状物
两支
结果分析与评价
1. 如果提取出来的不是白色丝状物，说明
DNA中的杂质较多。
2. DNA与二苯胺试剂呈 ，颜色的深浅与 有关。
蓝色
DNA的含量
考点注意
1. 如果使用离心方法，共有2次离心：第1次取上清液，第2次取沉淀物。
如果低温静置后取上清液，后加入遇冷酒精再静置，溶液出现白色丝状物即粗提DNA。
DNA
+
二苯胺
蓝色
沸水加热
练习与应用
一、概念检测
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D.用来识别特定基因的DNA探针
A
二、拓展应用
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的
DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端

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