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(共45张PPT)
第2节 动物细胞工程
（第一课时）
希普：首例胚胎移植成功
哈里森:首创动物组织体外培养法
张明觉：发现哺乳动物精子获能现象
格登、童第周：体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥：获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
科技探索之路
动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程
皮肤的自体移植
灰绿色
小面积烧伤：患者通过切除 + 植皮(自身)后恢复
患者自身皮肤的不够用，如何解决？
大面积烧伤？
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
从社会中来
1）使用他人皮肤？
2）培养自身细胞？
情境一：从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
问题1:怎样获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程
是最基础的技术
问题2:什么是动物细胞培养？
人造皮肤
烧伤病人
2
3
1
合作探究一：阅读教材P43—44，结合选择性必修一所学内容思考以下问题，小组合作思考讨论完成问题。
一、动物细胞培养
什么是动物细胞培养？原理是什么？目的是什么？
动物细胞培养实际上是在体外模拟体内的生理条件进行的培养，你认为体外培养动物细胞需要满足哪些条件
如何维持无菌、无毒的环境？适宜的温度、pH和渗透压分别是多少？适宜的气体环境包括？分别有什么作用？如何保持该气体环境？
一、动物细胞培养
1.概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
原理
地位
对象
目的
细胞有丝分裂
动物细胞工程的基础
胚胎或幼龄动物的细胞
获得细胞或者细胞产物
问题3:那么，动物细胞的培养需要哪些条件呢？
知识回顾：
还记得细胞生活的环境吗？
细胞外液的主要成分呢？
一、动物细胞培养
知识回顾：
细胞外液的主要成分呢？
一、动物细胞培养
一、动物细胞培养
2.培养的条件：
动物细胞培养所需的基本条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。
培养基的构成：合成培养基 + 血清等天然成分
一般使用液体培养基，也称为培养液。
一、动物细胞培养
2.培养的条件：
(1)无菌、无毒的环境：
无菌
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
无毒
定期更换培养液
问题4:定期更换培养液的目的是什么？
以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
问题5:如何防止培养过程中的微生物污染？
在细胞培养液中添加一定量的抗生素
一、动物细胞培养
2.培养的条件：
(2)温度、PH、渗透压：
多数动物细胞生存的适宜pH为________
①适宜的温度：
36.5±0.5℃
7.2-7.4
维持细胞正常的形态和功能
哺乳动物细胞培养的温度多以_ __________为宜；
维持适宜渗透压的目的______________________
②适宜的pH：
③适宜的渗透压：
（1）气体组成及作用：
95%空气：
5%CO2：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）具体操作(培养仪器)：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有 和 的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
CO2培养箱
培养皿
培养瓶
一、动物细胞培养
2.培养的条件：
(3)气体环境：
5%CO2
95%空气
不同气体的作用是什么？
O2:
　实战训练　
1．对某种动物的肝肿瘤细胞进行细胞培养，下列叙述错误的是（　　）
A．在利用肝组织块制备细胞悬液时，可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理B．动物细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞呼吸
C．动物细胞培养过程中必须保证培养环境是无菌、无毒的
D．在合成培养基中，通常需加入血清等天然成分
　实战训练　
2．下列与动物细胞培养有关的叙述，不正确的是（ ）
A．动物细胞培养的原理是细胞的全能性
B．CO 的作用是维持细胞培养液pH的相对稳定
C．动物细胞培养需要添加一定量的动物血清
D．可以用体外培养的人体细胞培养病毒
　实战训练　
3．无菌操作在微生物培养、植物组织培养和动物细胞培养中都至关重要。下列叙述正确的是（ ）
A．生物技术实验中所有器皿、培养基及生物材料均需进行灭菌处理B．酒精能使细胞中的蛋白质变性失活，95%的酒精用来消毒效果最好C．动物细胞培养基配置时，加入抗生素即可达到无菌培养的目的D．易分解的活性物质过滤除菌后，在无菌条件下加入灭菌的培养基中
合作探究一：请同学们自主阅读教材P44-45，小组合作思考讨论完成问题。
一、动物细胞培养的过程
1.体外培养动物细胞有哪些类型？
2.请简述动物细胞培养的过程。
3.为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？
4.为什么将取出的组织分散成单个细胞？如何将组织分散成单个细胞？说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶可以吗？
5.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
6.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？
7.什么是原代培养和传代培养？两种“培养”都用到胰蛋白酶处理，对象相同吗？
二、动物细胞培养的过程
(一)动物细胞培养的类型：
第1类：悬浮生长细胞
第2类：贴壁生长细胞
（主流）
接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。
悬浮培养瓶
细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。
细胞贴壁生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
培养皿
培养瓶
接触抑制现象：细胞间相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加。
刚开始铺展贴壁生长
贴壁生长并进行有丝分裂
单层相互接触出现接触抑制
接触抑制是体外细胞培养时贴附型细胞生长的特性。一般情况下，正常的细胞在培养过程中不停顿地活动和运动，其外周的细胞膜呈现一些特征性的皱褶样活动。但是，当细胞由于移动而相互靠近发生接触时，细胞不再移动，接触区域的细胞膜皱褶样活动停止，最终细胞分裂停止，这种现象称为接触抑制。由于细胞之间有接触抑制的特性，一般的正常细胞并不重叠于其他细胞之上生长，而是单层生长。癌细胞由于无接触抑制而能够继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，发生堆积。因此，是否接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。
小资料
单层生长的肝细胞（100×）
二、动物细胞培养的过程
二、动物细胞培养的过程
1.动物细胞培养的类型：
接触抑制
原代培养
传代培养
细胞贴壁
大多数体外培养的细胞需要贴附于某些基质表面才能生长增殖
当贴壁细胞分裂生长到表面互相接触时，细胞通常会停止分裂增殖
将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养
将分瓶后的细胞培养称为传代培养
取动物组织
分散成单个细胞
细胞悬液
原代培养
用机械的方法， 或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
加培养液
放入培养皿或培养瓶内
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖（悬浮生长）
一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（贴壁生长）
细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液营养物质缺乏等分裂受阻
接触抑制
CO2培养箱中
传代培养：将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理分散成单个细胞，再用离心法收集
大多数细胞
二、动物细胞培养的过程
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
(1)取材:
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
(2)取材原因:
其细胞生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强。
2.取动物组织
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
3. 将组织分散成单个细胞
(1)原因:
(2)方法:
从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。
利于从培养液中获得营养，排出代谢废物，利于继续培养。
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理。
动物细胞间的物质主要是蛋白质。
不行。
思考：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
注意：
不能用胃蛋白酶将组织分散成单个细胞，因为胃蛋白酶的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活。
思考：胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？
注意：
动物细胞间的物质主要是蛋白质。使用胰蛋白酶时，应注意控制好作用时间。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，细胞膜也含有蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
能，应注意时间的控制。
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，使细胞分散开，获得单个细胞
胃蛋白酶不可以，pH不适宜
细胞膜含有蛋白质，长时间处理会损伤细胞，要控制好时间。
(3)胰蛋白酶的作用：
(4)胃蛋白酶可以吗？理由：
(5)用胰蛋白酶处理组织时应注意什么？
4.分散成单个细胞
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
5.制细胞悬液培养
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
②贴壁生长类：
(1)操作方法：
(2)体外培养的动物细胞类型
【重要概念】
原代培养：指分瓶之前，动物组织经处理后的初次培养。
传代培养：分瓶后的细胞培养。
细胞贴壁：大多数细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。
正常细胞
平面观
（2）癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。
肿瘤细胞
失去接触抑制
注意：
（1）正常细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，当细胞相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加，最后形成一层（或单层）。
思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，
就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，
举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。
癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
肿瘤细胞失去接触抑制，
条件适宜在培养液可以无限增殖下去。
一、动物细胞培养的过程
正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。
癌细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，适宜条件下可以无限增殖。
思考：为什么癌变细胞没有接触抑制现象？
思考：悬浮生长细胞和贴壁生长细胞培养过程有什么不同？
悬浮生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
贴壁生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→先胰蛋白酶处理→再离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
思考：动物细胞培养时，除了添加糖类、氨基酸等必要的营养成分外，往往还需添加血清等一些天然成分，原因是？
人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。
血清等一些天然成分的营养成分比较齐全，可以弥补人工培养基的不足。
一、动物细胞培养的过程
6.动物细胞培养的意义：
（1）生物制品
酶、生长因子、疫苗、单克隆抗体等
（2）进行有毒物质和药物的检测
（3）临床治疗 （如人工皮肤）
（4）生物学基础研究 （细胞全能性的揭示、细胞周期及调控、癌变机理及细胞衰老的研究）
①取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞
②分散组织细胞
一般选择幼龄动物或者是动物的胚胎;所取动物组织块一般体积大于1mm3 。
注意
③制成细胞悬液
用培养液将细胞制成细胞悬液
放入培养皿或培养瓶内
培养皿
培养瓶
④转入培养液中进行原代培养
⑤放入CO2培养箱中培养
⑥传代培养
原代培养：
人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
传代培养：
将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
问：细胞可以一直进行传代培养吗？
转瓶培养后的细胞一般传至 10 代左右，细胞的生长、分裂就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但也有极少数细胞能存活下来，并可传至 40~50 代，这种传代细胞称为细胞株（如人的成纤维细胞可传30～50代，相当于150～300个细胞周期）。一般情况下，当细胞株传至 50 代以后会再次出现停滞，不能继续传代，但有部分细胞的遗传物质发生了改变，并带有癌变的特点，从而有可能在适宜培养条件下无限传代下去，这种传代细胞叫作细胞系。（了解）
动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养的过程
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
遗传物质部分改变
遗传物质一般不改变
多数细胞固定在表面生长和分裂
随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
一、动物细胞培养的过程
7.原代培养和传代培养的鉴定：
培养危机：
危机1
危机2
问题6:两种“培养”都用到胰蛋白酶处理，对象相同吗？
一、动物细胞培养的过程
区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象
第一次
用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。
细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
第二次
问题7:请列表比较动物细胞培养和植物组织培养。
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的物理性质
培养基的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分无机营养成分植物激素
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清
植物激素
血清
一、动物细胞培养的过程
植物组织培养和动物细胞培养的比较
植物组织培养 动物细胞培养
特殊环境条件
结果
是否体现细胞的全能性
过程
相同点 再分化需光
气体环境
一般获得新的植株
获得大量细胞
是
否
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
幼苗
完整植株
移栽成活
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
一、动物细胞培养的过程
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
一、动物细胞培养的过程
课堂小结
动物细胞培养
动物细胞培养的概念和原理
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
原理：细胞的增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
(1)营养条件
(2)无菌、无毒的环境
(3)温度、pH和渗透压
(4)气体环境
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
　实战训练　
（1）动物细胞培养体现了动物细胞的全能性（　 　）
（2）培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞（　 　）
（3）悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集（　 　）
（4）动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH（　　 ）
5.判断常考语句，澄清易混易错
　实战训练　
6．治疗大面积烧伤时，可通过细胞培养构建“人造皮肤”进行移植。下列叙述错误的是（ ）
A．使用烧伤病人健康皮肤细胞可培养出不产生免疫排斥反应的“皮肤”
B．用胰蛋白酶处理皮肤组织，目的是使它分散成单个细胞
C．贴壁生长的皮肤细胞会发生接触抑制现象
D．传代培养时，贴壁细胞直接用离心法收集，然后再分瓶培养
　实战训练　
7．2013年8月，世界上第一个“试管汉堡”问世，其中的“牛肉饼”是科学家通过体外培养牛的细胞而得到的，其基本流程如图所示。有关说法正确的是（　　）
A．甲处还需要胰蛋白酶的处理
B．乙处利用液体悬浮培养获得单细胞
C．丙处需添加高压蒸汽灭菌后的动物血清
D．丙处采用开放式培养以减少培养基pH的波动

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