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第2章 细胞工程
指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法,通过细胞器、细胞或组织水平上的操作,有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。P31
原理和方法
操作水平
目的
分类
细胞生物学、分子生物学和发育生物学
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品
概念
细胞工程
细胞器、细胞或组织
植物细胞工程和动物细胞工程
哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
植物细胞工程的发展历程 P32
1902年
1958年
1960年
1964年
1971年
1974年
【科技探索之路】
科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体
卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
叶子
花瓣
花粉
细胞
植物体
植物细胞工程 的基本技术
植物组织培养
植物体细胞杂交
植物细胞工程的理论基础是什么
植物细胞的全能性
一.植物细胞工程的基本技术
P35植物细胞工程的基本技术
1.全能性定义：
2.具有全能性的原因：
3.体现全能性的标志 ：
4.不体现全能性的原因：
5.细胞全能性的大小与细胞分化程度的关系：
【自主学习】阅读教材P34，结合所学内容思考以下问题：
(一)细胞的全能性
1.全能性定义：
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
(一)细胞的全能性
叶子
花瓣
花粉
细胞
植物体
(一)细胞的全能性
每一个体细胞都是由同一个受精卵细胞经有丝分裂增殖分化而形成的。
体细胞内的遗传物质（基因）与受精卵完全一样。
2.具有全能性的原因：
生物体的细胞含有该物种所特有的全套遗传物质。
3.体现全能性的标志：
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
a胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
b受精卵发育成个体（动植物）
c蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰
d用一粒花粉繁殖出新的植株
e芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶
4.不体现全能性的原因：
基因在特定时间、空间条件下选择性表达
(一)细胞的全能性
√
√
√
√
即基因的选择性表达
5.细胞全能性的大小与细胞分化程度的关系：
①受精卵>胚胎干细胞>生殖细胞>体细胞；
②植物细胞>动物细胞。
一般情况下，随着细胞分化程度的不断提高,细胞的全能性逐渐降低。
【说明】特例：
卵细胞虽然已经高度分化，但仍具有较高的全能性。
(一)细胞的全能性
从社会中来
从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢兰花。但是兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长，繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。
国画作品《兰》
问题:可利用兰花的一片叶、一片花瓣、一粒花粉或一个细胞进行繁殖来解决上述问题吗？为什么？
细胞具有全能性
植物组织培养技术
①外植体消毒
②外植体切段
③接种外植体
④诱导愈伤组织
⑤诱导生芽生根
⑥炼苗、移栽
(二)植物组织培养技术
菊花的组织培养
1.探究 实践
(1).实验步骤：
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
炼苗、移栽
冲掉茎段上的灰尘、泥土等
(二)植物组织培养技术
(1).实验步骤：
1.双手和超净工作台
酒精擦拭
2.流水冲洗后的外植体（幼嫩的茎段）：
酒精消毒
30s
无菌水
2~3次
次氯酸钠
30min
无菌水
2~3次
注意消毒的时间,既要达消毒的效果
又不能杀死外植体
无菌水冲洗目的：防止消毒液残留
消毒过度杀死外植体
（生理状况好，细胞分化程度较低，其全能性易表达）
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
炼苗、移栽
探究 实践
防止杂菌生长。
杂菌一方面与培养物竞争营养；
另一方面产生有害物质危害培养物。
为什么进行无菌操作？
(1).实验步骤：
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
炼苗、移栽
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成
0.5～1cm长的小段。
探究 实践
(1).实验步骤：
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
炼苗、移栽
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
探究 实践
接种外植体时，不要倒插！
（将“形态学上端”朝上）
(1).实验步骤：
1）培养基名称： ；
2）物理性质： ；
3）碳源： 。
拓展1：植物组织培养常用的培养基配方
P116
MS培养基
固体培养基
蔗糖（有机碳源）
蔗糖：提供碳源和能源
MS培养基中为什么用蔗糖而不用葡萄糖？
同样可以作为植物细胞的碳源和能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。 此外，微生物生长所需的碳源最适合的是葡萄糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。
生长素
细胞分裂素
（课本P116）
有机营养如蔗糖（提供碳源和能源，调节渗透压）、植物激素（生长素、细胞分裂素等）、天然附加物、水、无机营养（大量元素、微量元素）
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
炼苗、移栽
探究 实践
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18~22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
避光
有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
(1).实验步骤：
在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞失去其特有的结构
和功能，转变为未分化的细胞，进而形成愈伤组织的过程。
不定形的薄壁组织团块。细胞排列疏松且无规则，高度液泡化
相关概念P35
脱分化：
愈伤组织：
脱分化：
注意：无叶绿体，可进行有丝分裂
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
炼苗、移栽
探究 实践
培养15~20天后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
置于光照！
芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
诱导生芽
诱导生根
1.照光培养 2.先生芽后生根，培养基不同
若先生根后面
就不易生芽
相关概念P35
再分化：
愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程。
再分化：
再分化实质：
基因选择性表达
菊花的组织培养
外植体的消毒
外植体的切段
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽生根
炼苗、移栽
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。
用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。
每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
探究 实践
炼苗！
移栽！
观察！
透气,持水性较好，利于幼苗生根和叶片的生长
防止杂菌污染
(二)植物组织培养技术
菊花的组织培养
根据菊花的组织培养的操作过程，思考从外植体到发育成一棵完整的植株幼苗，依次经历了那些重要的生理过程？
移栽成活
脱分化：
再分化：
再分化：
(二)植物组织培养技术
菊花的组织培养
移栽成活
脱分化：
再分化：
再分化：
根据菊花的组织培养的操作过程，概述植物组织培养的定义吗？
(2).根据概念，判断：
①要使已分化的细胞、组织、器官表现出全能性需要什么条件？
②植物组织培养利用的原理：
③植物组织培养的生殖方式 ，
细胞分裂方式_________。
(1).植物组织培养的概念：
指将 的 等，培养在
上，给予 ，诱导其 的技术。
植物器官、组织或细胞
人工配制的培养基
适宜的培养条件
形成完整植株
植物细胞具有全能性
无性生殖
离体
②营养物质
提供能量，调节渗透压
（常用MS培养基）
适宜的温度、PH、无菌条件
(水、无机盐、蔗糖等有机物和植物激素)
有丝分裂
①②③
①
③
(二)植物组织培养技术
4. 进一步探究
若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？
① 空白对照：不加任何激素；
② 实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；
③ 实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；
④ 实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
思维提升
菊花的组织培养
生长素/细胞分裂素 比值 实验结果
高 （ >1 ）
低 （ <1 ）
适中 （ ≈1 ）
有利于根的分化,抑制芽的形成
有利于芽的分化，抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
拓展：植物组织培养的两种途径
器官发生途径
胚状体途径
胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但经过胚胎发育过程形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
生芽、生根
或胚状体
试管苗
（移栽到大田）
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么好妙招？不能。因为两种生物之间存在着天然的生殖隔离利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？“番茄-马铃薯”的假想图1．你认为两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么？应该怎么处理？
2．有没有一种温和的去壁方法呢？
3．两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？
4.实现原生质体融合可以采用哪些技术手段？
5．如何将杂种细胞培育成杂种植株？
自主学习P36—37的内容，完成以下问题。
去细胞壁
酶解法（纤维素酶和果胶酶）
流动性
物理法和化学法
植物组织培养技术
(二)植物体细胞杂交技术
你能根据上面问题的启示，简述植物体细胞杂交技术操作过程吗？
1.过程
植物细胞融合 + 植物组织培养
去壁
①
去壁
①
融
合 ②
再生
新壁
③
脱分化
④
再分化
⑤
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交
(二)植物体细胞杂交技术
原理：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性
原生质体
原生质层
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
原生质层
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质
①去壁原因： 。
②方法： 。 ③相关酶： 。
*为什么用上述酶？ *酶解法利用了原理？___________
*纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？
细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）
酶解法
纤维素酶和果胶酶
酶的专一性
使溶液具有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破，保持原生质体正常
（1）去除细胞壁
指脱去细胞壁的细胞
(二)植物体细胞杂交技术
去壁时应将细胞放在等渗溶液或略大于的溶液中
2.过程解读
提示：纤维素酶和果胶酶。因为植物细胞的细胞壁主要由纤维素和果胶组成，利用酶的专一性，在降解植物细胞的细胞壁时要利用纤维素酶和果胶酶。
“练习与应用”2题拓展P38:科学家在制备原生质体时，有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分？理由是什么？
(二)植物体细胞杂交技术
方法：
理论基础：
（2）原生质体间的融合
细胞膜具有一定的流动性
方法： 物理方法：电融合法、离心法
化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+-高pH融合法
(二)植物体细胞杂交技术
2.过程解读
1.番茄原生质体与马铃薯原生质体融合后，有哪几种类型(只考虑两两融合)？而我们需要的是哪种类型？所以原生质体融合后，我们要进行怎样的处理？
思考
3种类型：番茄-番茄融合细胞、马铃薯-马铃薯融合细胞、番茄-马铃薯杂交细胞。
我们需要的是番茄-马铃薯杂种细胞。
因此要对融合后的原生质体进行筛选。
重新产生出细胞壁
质壁分离和质壁分离复原实验
（3）再生细胞壁：
高尔基体、线粒体
(二)植物体细胞杂交技术
2.过程解读
①细胞融合完成的标志：
②与新细胞壁形成有关的细胞器：
如何设计实验验证再生出新细胞壁
番茄原生质体与马铃薯原生质体融合后，有哪几种类型(只考虑两两融合)？而我们需要的是哪种类型？所以原生质体融合后，我们要进行怎样的处理？
3种类型：番茄-番茄融合细胞、马铃薯-马铃薯融合细胞、番茄-马铃薯杂交细胞。
我们需要的是番茄-马铃薯杂种细胞。
因此要对融合后的原生质体进行筛选。
（3）再生细胞壁：
(二)植物体细胞杂交技术
2.过程解读
2.若番茄细胞具有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb。马铃薯细胞含有4y条染色体，4个染色体组，基因型为ccccDDdd。
深度思考
6（异源六倍体）
染色体数目变异
2x＋4y
AabbccccDDdd
从杂种植株的染色体组成上看属于何种变异？
杂种细胞染色体数为？
杂种细胞染色体组数为？
杂种细胞基因型为？
去壁
①
去壁
①
融
合 ②
再生
新壁
③
脱分化
④
再分化
⑤
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交
(二)植物体细胞杂交技术
2.过程解读
植物体细胞杂交完成的标志
原生质体融合成功的标志
主要原因是∶生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
"番茄—马铃薯"杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么
拓展P38
两种生物的基因直接或间接的作用，导致彼此影响或干扰
(二)植物组织培养技术根据上述操作过程，你能概述植物体细胞杂交技术的概念吗？去壁①去壁①融合②再生新壁③脱分化④再分化⑤移栽1.过程4.融合实例:
1.概念：
将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
3.步骤：
5.意义:
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。
2.理论基础：
细胞膜的流动性和细胞全能性
无性生殖
生殖类型：
分裂方式：
变异类型：
有丝分裂
染色体（数目）变异
(二)植物体细胞杂交技术
获得原生质体
诱导原生质体融合
杂种细胞
愈伤组织
诱导
形成
完整的杂种植株
发育
比较
植物组织培养技术 植物体细胞杂交技术
繁殖 方式
原理
主要步骤
意义
联系 无性繁殖
植物细胞全能性
①脱分化
②再分化
保持优良性状繁殖速度快、大规模生产提高经济效益
植物体细胞杂交技术应用了植物组织培养
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
①去除细胞壁
②融合形成杂种细胞
③植物组织培养
细胞膜流动性、植物细胞全能性
无性繁殖
课堂小结
1．科学家用植物体细胞杂交技术，将番茄的原生质体和马铃薯的原生质体融合，成功地培育出了番茄—马铃薯杂种植株，培育过程如图所示，其中①～⑤表示过程，英文字母表示细胞、组织或植株。据图回答下列问题：
(1)在植物体细胞杂交技术中，过程①中常用　　 　　　处理植物细胞以除去　　 　　，得到　　　　　　。(2)过程②表示　　　　 　　。依据的生物学原理是　 　，常用的化学试剂是　　 　。(3)与过程③密切相关的具有单层膜结构的细胞器是　　　　　　。
课堂检测
(4)在利用杂种细胞培育杂种植株的过程中，依据的原理是　　　　　　　　　　，其中过程④表示　 　　　过程，过程⑤涉及的细胞分裂方式为　　　 　　　。(5)若番茄细胞内含m条染色体，马铃薯细胞内含n条染色体，则番茄—马铃薯杂种植株的体细胞内含　　 　　条染色体；若由杂种细胞培育成的番茄—马铃薯植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培养得到的植株为　 　　倍体。
纤维素酶和果胶酶
细胞壁
原生质体
诱导原生质体融合
细胞膜具有一定的流动性
聚乙二醇
高尔基体
植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
脱分化
有丝分裂
m+n
单

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