资源简介

(共57张PPT)
第二节 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
目的基因：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要是编码蛋白质的基因
△ 根据不同的需要，
目的基因是不同的
例如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
（1）原核生物基因
终止子：终止转录
目的基因的筛选与获取
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
加 工
mRNA前体
成熟mRNA
不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列
编码序列=外显子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
（2）真核生物基因
转 录
目的基因的筛选与获取
　 科学工作者分离得到了基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对，结果如图所示。
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
明确了目的基因后，该怎么获得它
序列数据库（如GenBank）
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
序列比对工具（如BLAST）
目的基因的筛选与获取
目的基因获取方法
利用PCR获取和扩增目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
通过DNA合成仪直接合成
从基因文库中获取
人工合成
目的基因的筛选与获取
①建立基因组文库
某生物所有DNA
特定的限制酶
基因组所有基因
每个基因和载体结合重组DNA分子
导入受体菌
基因组文库
(1)从基因文库中直接获取
目的基因的筛选与获取
②建立cDNA基因文库
某种生物的成熟mRNA
单链DNA
双链DNA片段（cDNA）
导入受体菌中储存
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
与载体连接
目的基因的筛选与获取
DNA合成仪
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
(2)人工合成
目的基因的筛选与获取
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
苏云金杆菌
Bt基因
快速获得大量Bt基因
提取
PCR技术
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
体内DNA复制要点回顾
条件
原料：游离的4种脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
复制原则：
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
目的基因的筛选与获取
体外DNA复制的条件
参与的组分 在PCR中的作用
前提条件
高温
模板DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
主要是DNA单链或RNA,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
已知基因的核苷酸序列
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
目的基因的筛选与获取
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
目的基因的筛选与获取
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
目的基因的筛选与获取
设计引物的依据是：
目的基因两端的核苷酸序列
使用的一对引物的序列相同吗？
不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列
DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链
需要引物的原因是：
目的基因的筛选与获取
3`
5`
5`
3`
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
模板DNA
目的基因
92
55
75
℃
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
变性
3`
5`
5`
3`
第一轮
含有目的基因的双链DNA片段
DNA解聚为单链
温度上升到90℃以上
变性
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
两条DNA单链
引物和两条单链DNA碱基互补配对
温度下降到50℃左右
复性
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
引物和互补DNA结合
脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则合成新的DNA链
温度上升到72℃左右
延伸
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
变性
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
变性
第三轮
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
退火
第三轮
目的基因的筛选与获取
92
55
75
℃
延伸
第三轮
思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
PCR技术的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数
含引物的DNA分子数
含其中一种引物的DNA分子数
同时含两种引物的DNA分子数
共消耗引物数
共消耗引物对数
第n代消耗引物数
含等长的DNA分子数
2
2
3
2
2
4
4
8
8
1
1
0
0
0
3
7
2
6
14
7
6
2n
2n
2n-1
2n-2
2n-1
2n+1-2
2n-2n
2
2n
4
8
目的基因的筛选与获取
项目 PCR技术 体内DNA复制
相同点 原理 原料 条件 不同点 场所
解旋方式
酶
引物
特点
是否需要ATP
温度条件
结果
碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸
均需要模板、引物、酶等
细胞外
（主要在PCR仪内）
（主要在细胞核内）
细胞内
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
解旋酶、普通的DNA聚合酶
一小段RNA或单链DNA分子片段
一小段RNA
体外迅速扩增
边解旋边复制
不需要（dNTP提供）
需要
需控制温度，在较高温度下进行
细胞内温和的条件
短时间内可形成大量的DNA片段
形成完整的DNA分子
目的基因的筛选与获取
用PCR可以扩增mRNA吗？
不可以（Taq酶以DNA为模板，且RNA不稳定，需要逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子
DNA片段的扩增及凝胶电泳
PCR仪
DNA分子电泳
DNA片段的扩增及凝胶电泳
实验原理
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
1987年的PCR仪
可变温的PCR仪
PCR扩增DNA片段还利用了_____________________的原理；
DNA半保留复制
DNA片段的扩增及凝胶电泳
2、DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
DNA片段的扩增及凝胶电泳
DNA片段的扩增及凝胶电泳
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA片段的扩增及凝胶电泳
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？
基因表达载体的构建
获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
基因表达载体的构建
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
位置：基因的下游
功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
基因表达载体的作用：
① 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；
② 使目的基因能够表达和发挥作用。
☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
基因表达载体的构建
使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+转化法
病毒介导法
显微注射法
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
将目的基因导入受体细胞
资料卡
花粉管通道法
花粉管通道法：在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
将目的基因导入受体细胞
资料卡
农杆菌转化法
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。
②原理：
将目的基因导入受体细胞
转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
将目的基因导入受体细胞
例1.该过程经过____次拼接、____次导入？
(1)第一次拼接
___________________________
(2)第二次拼接
___________________________
___________________________
(3)第一次导入
___________________________
(4)第二次导入
___________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
转入
农杆菌
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
将目的基因导入受体细胞
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
资料卡
Ca2+处理法
微生物（常用大肠杆菌）
将目的基因导入受体细胞
资料卡
显微注射法
利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。
将目的基因注射到动物受精卵中
显微注射
将目的基因导入受体细胞
资料卡
病毒介导法
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
将目的基因导入受体细胞
腺病毒载体新冠疫苗的制备
将编码新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因组中，接种后，随载体增殖，大量所需的抗原得以表达。
接种疫苗，责无旁贷！
将目的基因导入受体细胞
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
目的基因的检测与鉴定
基因是否插入染色体DNA（存在）
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
目的基因的检测与鉴定
基因是否插入染色体DNA（存在）
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
方法2：DNA分子杂交技术
DNA分子杂交(Sorthern Blot)流程图
目的基因的检测与鉴定
基因是否转录（mRNA）
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
提取RNA
转基因生物
标记的基因探针
方法1：PCR扩增
方法2：RNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基因是否翻译（蛋白质）
抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
(Western Blot)流程图
目的基因的检测与鉴定
转基因生物 检测方法 观察指标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
目的基因的检测与鉴定
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR、核酸分子杂交技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
检测内容及方法
小结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。

展开更多......

收起↑