资源简介

(共23张PPT)
首例胚胎移植成功
首创动物组织体外培养法
发现哺乳动物精子获能现象
体细胞核移植成功
试管家兔诞生
创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
分离和培养小鼠胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
动物细胞工程（含胚胎工程）发展历程
思考：怎样获得大量自体健康皮肤？能否用自体皮肤细胞培养出可移植皮肤？
可从病人身上取少量正常健康皮肤在体外培养、扩增。这里涉及到动物细胞工程很多技术！
江西生物组 东东老师
学习目标：
1．阐明动物细胞培养的条件和过程。
2．简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
3．阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程,认同单克隆抗体在临床上有重要的
应用价值。
4．阐明利用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和该技术的应用前景。
第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
一、动物细胞培养 （一）动物细胞培养的条件
动物细胞培养：从动物体中取出相关的组织或器官（胚胎或幼龄动物的细胞，细胞分化程度低、分裂能力强，易培养），将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
思考：动物细胞培养需要哪些必要的条件？培养的过程又是怎样的呢？
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
生产单克隆抗体
动物细胞工程的基础
动物细胞工程技术
克隆动物
动物细胞培养所需基本条件
其他环境条件
营养条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素……
无菌、无毒的环境；
适宜的温度、pH和渗透压；
适宜的气体环境。
一、动物细胞培养 （一）动物细胞培养的条件-营养
1．营养
①已知成分:将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基。称为合成培养基。
②未知成分：使用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分。血清中含有人类尚未全部研究清楚、细胞生长和增殖所必需的物质。
+
合成培养基
10%～20%的血清
注意：培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
血清中不仅含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养物质，还有激素及多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。
天然培养基
一、动物细胞培养 （一）动物细胞培养的条件-无菌、无毒的环境
2．无菌、无毒的环境
无菌
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液，以便清除代谢物
无毒
（防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害）
①湿热灭菌
②干热灭菌
③灼烧灭菌
培养的细胞一旦被污染，多数无法挽回，需尽快弃之，以防止污染扩大而影响其他细胞。
在培养基中加入抗生素也能抑制细菌和真菌的生长，从而预防污染。
有毒物质
维持适宜渗透压的目的 。
哺乳动物细胞培养的温度多以 为宜；
一、动物细胞培养 （一）动物细胞培养的条件-温度、pH和渗透压
3．温度、pH和渗透压
多数动物细胞生存的适宜pH为 。
①适宜的温度：
36.5±0.5℃
7.2-7.4
维持细胞正常的形态和功能
②适宜的pH：
③适宜的渗透压：
一、动物细胞培养 （一）动物细胞培养的条件-气体环境
4．气体环境
动物细胞培养所需气体主要有___和____。
O2
CO2
CO2培养箱
通常采用培养皿或松盖培养瓶。并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
O2：细胞代谢所必需的。
CO2：主要作用是维持培养液的pH。
培养箱不仅能提供气体环境，还提供了适宜的温度，还能控制稳定的pH环境。
造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2 ，为了解决这一问题，可采用开放式培养的方式，使细胞代谢产生的CO2 及时溢出培养器皿，再通过给培养箱提供恒定的5%的CO2 浓度，使之与培养基中的NaHCO 3 处于平衡状态，调节pH的相对稳定。95%的空气可以保证细胞呼吸对氧气的需要。
一、动物细胞培养 （二）动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
用机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
办法
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②传代培养：分瓶后的细胞培养。
思考：为什么要分瓶培养？怎样处理？
传代培养
悬浮培养的细胞:用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，再用离心法收集
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集
细胞
加培养液
【模型与建模】阅读课本44-45页，结合图2-12，利用文字和箭头表示动物细胞培养的过程。
加培养液
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（所取动物组织块体积大于1mm3 ），其细胞生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养；
分散成单个细胞便于从培养液中获得营养，排出代谢废物，利于继续培养，不分散细胞间会有接触抑制，不能正常生长。
方法：机械法、胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）等处理。细胞间质中含有水分、蛋白质、代谢废物及其他营养物质，其中起细胞间连接作用的主要是黏连蛋白。用胰蛋白酶分散细胞说明细胞间物质主要是蛋白质。用胃蛋白酶不行，因为胃蛋白酶的适宜pH是2-3，如果用胃蛋白酶来分散细胞，在胃蛋白酶发挥作用的情况下，细胞会被杀死，要保证细胞存活，胃蛋白酶又没有活性，不能分散细胞。
一、动物细胞培养 （二）动物细胞培养的过程
思考1：动物细胞培养用什么材料？为什么要分散成单个细胞？如何分散？能用胃蛋白酶吗？
处理时间太短，消化就不充分，不能使细胞充分分散开来。处理时间太长，会导致细胞膜表面蛋白大量被分解，从而导致细胞死亡！
思考2：胰蛋白酶处理时间需严格控制在2min左右吗？
成块的组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞生长和增殖。
思考3：为什么要将动物组织块分散成单个细胞，制成细胞悬液？体外培养的动物细胞类型有哪些？
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖，如血液、淋巴组织的细胞以及某些肿瘤细胞。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
②贴壁生长类：
动物
组织块
分散成
单个细胞
细胞悬液
思考4：什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
细胞贴壁过程
贴壁生长与接触抑制
圆球形细胞刚开始
铺展贴壁生长（100×）
培养的动物细胞贴壁生长
并进行有丝分裂（100×）
细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×）
细胞悬液
细胞贴壁
接触抑制
形成一层细胞
形成多层细胞
癌细胞（糖蛋白等减少）失去接触抑制，适宜条件在培养液可无限增殖！
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的物理性质
培养基的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分
无机营养成分
植物激素
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清
蔗糖、植物激素
葡萄糖、血清
思考5：动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处
植物组织培养 动物细胞培养
培养目的
特殊环境条件
结果
是否体现细胞的全能性
过程
相同点
再分化需光
气体环境
一般获得新的植株
获得大量细胞
是
否
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
幼苗
完整植株
移栽成活
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
获得细胞或细胞产物
快速繁殖等
思考5：动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处
一、动物细胞培养 （三）干细胞培养及其应用
【分析讨论】阅读课本46-47页，明确干细胞的概念、类型、特点及其应用，多能干细胞（IPS细胞）的特点、诱导方法，干细胞用于临床治疗可能存在什么问题？如何看待干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
胚胎干细胞(简称ES细胞)
（1）存在：早期胚胎中。
（2）作用：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
（3）成果：目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
干细胞：动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞（体积较小，细胞核大，核仁明显），存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
一、动物细胞培养 （三）干细胞培养及其应用
【分析讨论】阅读课本46-47页，明确干细胞的概念、类型、特点及其应用，多能干细胞（IPS细胞）的特点、诱导方法，干细胞用于临床治疗可能存在什么问题？如何看待干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
受精卵
原始胚胎干细胞
囊胚
胎儿
成人
胚胎干细胞
成体干细胞
成体干细胞
（1）存在：成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞。
（2）分类：包括造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等。
（3）作用：成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
细胞类型 胚胎干细胞(ES细胞) 成体干细胞
造血干细胞 神经干细胞 精原干细胞
来源 早期胚胎 骨髓、外周血和脐带血 神经系统 睾丸
作用 分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，具有进一步形成机体、所有组织和器官甚至个体的潜能 只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
特异性 不具有组织特异性 具有组织特异性
应用 有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用 将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段 神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)方面有重要的应用价值
诱导多能干细胞(iPS细胞)流程
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
诱导多能干细胞：科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞。可用于治疗白血病、帕金森病、阿而茨海默病等。诱导多能干细胞优点：①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
一、动物细胞培养 （三）干细胞培养及其应用
病人
神经细胞
肌肉细胞
血细胞
造血干细胞
体细胞
器官
① 诱导iPS细胞形成正常神经干细胞，可以治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾
② 诱导iPS细胞形成正常造血干细胞，移植后可恢复病人的造血和免疫功能。病（如帕金森病、阿尔兹海默症等）。
③ 诱导iPS细胞形成心肌细胞等，可以治疗心血管疾病。
诱导iPS细胞及其应用
动物细胞培养的过程
用机械法 或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
取动物组织
分散成单个细胞
接触抑制
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
解决方法
传代培养
分瓶
培养
细胞悬液
加培养液
原代培养
在培养皿或培养瓶内
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
细胞分裂受阻
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
课堂小结
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
本节小结
2．干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是（ ）
A．干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B．造血干细胞可以分化为各种血细胞
C．不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D．由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
练习与应用
一、概念检测
1．判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2。 （ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 （ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 （ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖 （ ）
×
√
A
×
×
练习与应用
二、拓展应用
1．现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。

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